347 12,7*1,24мм Тот баспайтын болаттан жасалған бұралған түтік, синхронды электростатикалық конденсацияның және α-синуклеин мен тау коагрегациясының молекулалық механизмі

Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Әр слайдта үш мақаланы көрсететін слайдерлер.Слайдтар арқылы жылжу үшін артқа және келесі түймелерді немесе әр слайд бойынша жылжу үшін соңында слайд контроллері түймелерін пайдаланыңыз.

347 Тот баспайтын болаттан жасалған құбырдың сипаттамасы

347 12,7*1,24мм Тот баспайтын болаттан жасалған бұралған түтік

Сыртқы диаметрі: 6,00 мм OD дейін 914,4 мм OD, Өлшемдері 24” NB дейін қолжетімді.

SS 347 Құбыр қалыңдығының диапазоны: 0,3 мм – 50 мм, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S және т.б. (0,5-12 мм) Немесе қалыпты емес өлшем қажет болған жағдайда бейімделеді

Түрі: SS 347 жіксіз құбырлар |SS 347 ERW құбырлары |SS 347 Дәнекерленген құбырлар |SS 347 Дайындалған құбырлар |SS 347 CDW түтіктері, LSAW құбырлары / тігіспен дәнекерленген / қайта сызылған

Пішін: SS 347 дөңгелек құбырлар/түтіктер, SS 347 шаршы құбырлар/түтіктер, SS 347 төртбұрышты құбырлар/түтіктер, SS 347 ширатылған түтіктер, SS 347 “U” пішіні, SS 347 табаға арналған катушкалар, SS 347 гидравликалық түтіктер

Ұзындығы: бір кездейсоқ, екі рет кездейсоқ және қажетті ұзындық соңы: тегіс ұшы, қиғаш ұшы, протекторлы

Соңынан қорғаныс: Пластикалық қақпақтар |Сыртқы әрлеу: 2B, №4, №1, №8 тот баспайтын болаттан жасалған құбырларға арналған айна әрлеуі, тапсырыс берушінің талаптары бойынша әрлеу

Жеткізу шарты: күйдірілген және маринадталған, жылтыратылған, ашық күйдірілген, суық тартылған

Тексеру, сынақ есептері: диірмен сынауының сертификаттары, EN 10204 3.1, химиялық есептер, механикалық есептер, PMI сынақ есептері, визуалды бақылау есептері, үшінші тарап тексеру есептері, NABL мақұлдаған зертханалық есептер, бұзушы сынақ есебі, бұзылмайтын сынақ есептері

Қаптама: ағаш қораптарға, пластик пакеттерге, болат жолақтарға оралған немесе тұтынушылардың сұранысы бойынша

Ерекшеліктер: Жоғарыда көрсетілгеннен басқа өлшемдер мен техникалық сипаттамалар сұраныс бойынша шығарылуы мүмкін

SS 347 құбыр өлшемі диапазоны: 1/2 дюймдік NB, OD - 24 дюйм

ASTM A312 347: Жоғары температура мен жалпы коррозияға қарсы қызмет көрсетуге арналған жіксіз және түзу дәнекерленген аустениттік құбыр.Дәнекерлеу кезінде металды толтыруға рұқсат етілмейді.

ASTM A358 347: коррозиялық және/немесе жоғары температурада қызмет көрсетуге арналған электр балқытумен дәнекерленген аустениттік құбыр.Әдетте бұл спецификацияға 8 дюймге дейінгі құбыр ғана шығарылады.Дәнекерлеу кезінде толтырғыш металды қосуға рұқсат етіледі.

ASTM A790 347: Жіксіз және түзу тігісті дәнекерленген ферритті/аустенитті (дуплексті) құбыр, жалпы коррозияға қарсы қызмет көрсетуге арналған, әсіресе кернеулі коррозия крекингіне төзімділікке баса назар аударады.

ASTM A409 347: коррозиялық және/немесе биіктікке арналған Sch5S және Sch 10S қабырғалары бар өлшемдері 14 дюймден 30 дюймге дейінгі үлкен диаметрлі аустениттік жеңіл қабырғалы құбырлар дәнекерленген түзу немесе спиральды тігісті электр балқыту

ASTM A376 347: Жоғары температураны қолдану үшін жіксіз аустениттік құбыр.

ASTM A813 347: Бір тігісті, бір немесе қос дәнекерленген аустениттік құбыр жоғары температураға және жалпы коррозиялық қолданбаларға арналған.

ASTM A814 347: Жоғары температура мен жалпы коррозиялық қызмет көрсетуге арналған салқын өңделген дәнекерленген аустениттік құбыр.

347H баспайтын болаттан жасалған құбырлардың химиялық құрамы

Тот баспайтын болаттан жасалған 347H құбырының механикалық қасиеттері

Тот баспайтын болаттан жасалған 347H құбырларының физикалық қасиеттері

347H тот баспайтын болаттан жасалған құбырға арналған эквивалентті бағалар

Амилоидты альфа-синуклеиннің (αS) агрегациясы Паркинсон ауруы мен басқа синуклеинопатияларға тән белгі болып табылады.Жақында әдетте Альцгеймер ауруымен байланысты тау протеині αS патологиясымен байланысты болды және екі ақуыздың коагрегациясының молекулярлық механизмі түсініксіз болса да, αS-қа бай қосындыларда бірге локализацияланатыны анықталды.Біз мұнда αS фазасының tau сияқты оң зарядталған полипептидтермен электростатикалық кешенді конденсация арқылы сұйық конденсаттарға бөлінетінін хабарлаймыз.Поликатиондарға αS аффинділігіне және коагуляциялық желінің валенттілігінің төмендеу жылдамдығына байланысты тромбтар тез гелденеді немесе коалесценциядан кейін баяу амилоидты агрегациядан өтеді.Жетілдірілген биофизикалық әдістер жиынтығын біріктіру арқылы біз сұйық-сұйық αS/Tau фазасының бөлінуін сипаттай алдық және сұйық ақуыз конденсатындағы екі ақуызды қамтитын гетерогенді агрегаттардың пайда болуына әкелетін негізгі факторларды анықтай алдық.
Мембраналық бөлімдерден басқа, жасушалардағы кеңістіктік бөлінуге сұйық-сұйық фазаның бөлінуі (LLPS) деп аталатын процесс арқылы биомолекулалық конденсат немесе тамшылар деп аталатын ақуызға бай, сұйық тәрізді тығыз денелердің пайда болуы арқылы да қол жеткізуге болады.Бұл тамшылар әдетте белоктар немесе белоктар мен РНҚ арасындағы көпвалентті уақытша әрекеттесу нәтижесінде түзіледі және барлық дерлік тірі жүйелерде әртүрлі қызметтерді атқарады.ЖШС қабілетті ақуыздардың үлкен саны табиғатта және биомолекулалық конденсаттардың түзілуінде өте ретсіз болып табылатын күрделілігі төмен тізбектерді көрсетеді3,4,5.Көптеген эксперименттік зерттеулер сұйық тәрізді конденсаттарды құрайтын ақуыздардың икемді, жиі ретсіз және көп валентті табиғатын анықтады, дегенмен бұл конденсаттардың қаттырақ конденсатқа дейін өсуі мен жетілуін бақылайтын арнайы молекулалық детерминанттар туралы аз мәлімет бар. күй..
Жаңа деректер аберрантты ақуызға негізделген LLPS және тамшылардың қатты құрылымдарға айналуы жиі дегенеративті аурулардың белгілері болып табылатын ерімейтін уытты агрегаттардың пайда болуына әкелетін тиісті жасушалық жолдар болуы мүмкін деген гипотезаны қолдайды.Көбінесе жоғары зарядталған және икемді LLPS-пен байланысты ішкі ретсіз белоктар (IDPs) ұзақ уақыт бойы амилоидты агрегация процесі арқылы нейродегенерациямен байланысты.Атап айтқанда, FUS7 немесе TDP-438 сияқты биомолекулярлық IDP конденсаттары немесе hnRNPA19 сияқты күрделілігі төмен домендері бар белоктар флюидизация деп аталатын процесс арқылы гель тәрізді немесе тіпті қатты пішіндерге дейін қартаюы көрсетілген.қосынды.уақыт функциясы ретінде немесе белгілі бір посттрансляциялық модификацияларға немесе патологиялық маңызды мутацияларға жауап ретінде қатты фазалық ауысуға (LSPT) 1,7.
In vivo LLPS-пен байланысты тағы бір IDP - бұл амилоидты агрегация Альцгеймер ауруына10 қатысы бар микротүтікшелермен байланысты бұзылған ақуыз, бірақ жақында Паркинсон ауруына (ПД) қатысы бар және басқа синаптикалық ядролық протеинопатиялар 11, 12, 13 байланысты.Таудың қолайлы электростатикалық әрекеттесулердің14 арқасында ерітіндіден/цитоплазмадан өздігінен диссоциацияланатыны көрсетілген, нәтижесінде электростатикалық коацерваттар деп аталатын тау-байытылған тамшылар пайда болады.Сондай-ақ, бұл спецификалық емес әрекеттесу түрі табиғаттағы көптеген биомолекулалық конденсаттардың қозғаушы күші болып табылатыны байқалды15.Тау ақуызы жағдайында электростатикалық агрегация қарапайым агрегация арқылы түзілуі мүмкін, онда ақуыздың қарама-қарсы зарядталған аймақтары бөліну процесін іске қосады немесе РНҚ сияқты теріс зарядталған полимерлермен әрекеттесу арқылы күрделі агрегация арқылы түзілуі мүмкін.
Жақында α-синуклеин (αS), синуклеинопатия17,18 деп аталатын PD және басқа нейродегенеративті аурулармен байланысты амилоидты IDP, сұйықтық тәрізді әрекеті бар ақуыз конденсаттарында шоғырланған жасушалық және жануарлар үлгілерінде19,20 көрсетілді.In vitro зерттеулері αS негізінен гидрофобты өзара әрекеттесу арқылы қарапайым агрегация арқылы LLPS-ке ұшырайтынын көрсетті, дегенмен бұл процесс ерекше жоғары ақуыз концентрациясын және атипикалық ұзақ инкубация уақытын қажет етеді19,21.In vivo байқалатын αS-құрамды конденсаттардың осы немесе басқа LLPS процестерімен түзілетіндігі шешілмеген негізгі мәселе болып қала береді.Сол сияқты, αS амилоидты агрегациясы PD және басқа синуклеинопатиялардағы нейрондарда байқалғанымен, αS жасушаішілік амилоидты агрегацияға ұшырауының нақты механизмі түсініксіз болып қалады, өйткені бұл ақуыздың шамадан тыс экспрессиясы бұл процесті өздігінен тудырмайтын сияқты.Қосымша жасушалық зақымданулар жиі талап етіледі, бұл жасушаішілік αS амилоидты жинақтарының ренуклеациясы үшін белгілі бір жасушалық орындар немесе микроорталардың қажет екенін көрсетеді.Агрегацияға ерекше бейім жасушалық ортаның бірі белок конденсаттарының 23 ішкі бөлігі болуы мүмкін.
Бір қызығы, αS және tau Паркинсон ауруы және басқа синуклеинопатиялары бар адамдарда тән ауру қосындыларында бірге локализацияланатыны анықталды 24,25 және эксперименттер екі ақуыз арасындағы синергетикалық патологиялық байланыс туралы хабарлады 26,27 агрегация αS және tau арасындағы әлеуетті қатынасты болжайды. нейродегенеративті ауруларда tau.ауру.αS және tau өзара әрекеттесетіні және бір-бірінің агрегациясына ықпал ететіні анықталды in vitro және in vivo 28,29 және синуклеинопатиясы бар науқастардың миында осы екі ақуыздан тұратын гетерогенді агрегаттар байқалды 30 .Алайда αS және tau арасындағы әрекеттесудің молекулалық негізі және оның коагрегация механизмі туралы аз мәлімет бар.αS жоғары теріс зарядталған C-терминал аймағы αS мен орталық пролинге бай тау аймағы арасындағы электростатикалық тартылыс арқылы tau-мен әрекеттеседі, ол да оң зарядталған қалдықтармен байытылған.
Бұл зерттеуде біз поли-L-лизин (pLK) сияқты басқа оң зарядталған полипептидтермен әрекеттесуінен айырмашылығы, тау протеинінің қатысуымен электростатикалық кешенді конденсация арқылы αS шынымен тамшыларға диссоциацияланатынын және осы процесте .αS тамшылар желісі үшін тірек молекуласы ретінде әрекет етеді.Біз электростатикалық αS коацерваттарының жетілу процесінде айтарлықтай айырмашылықтарды анықтадық, олар коацерват желісіне қатысатын ақуыздардың өзара әрекеттесуінің валенттілігі мен күшінің айырмашылығымен байланысты.Бір қызығы, біз ұзақ өмір сүретін сұйық коацерваттарда αS және тау амилоидты белоктарының коагрегациясын байқадық және осындай коацерваттарда осы екі ақуыздың бірлескен агрегациясына әкелетін кейбір негізгі факторларды анықтадық.Мұнда біз ауруға тән қосындылардағы екі ақуыздың коллокализациясының негізінде жатқан ықтимал молекулалық механизм болып табылатын бұл процесті егжей-тегжейлі сипаттаймыз.
αS бейтарап рН кезінде жоғары анионды C-терминал құйрығына ие (1а-сурет) және біз оның поликатионды ретсіз полипептидтік молекулалармен электростатикалық кешендердің конденсациялануы арқылы LLPS өтуі мүмкін деп болжадық.Бейтарап рН 32 кезінде оң зарядталған және ретсіз полимерлі табиғатына байланысты бастапқы модель молекуласы ретінде біз 100 қалдық поли-Л-лизинді (pLK) қолдандық. Біріншіден, біз pLK ерітіндінің ЯМР спектроскопиясы арқылы αS Ct доменімен әрекеттесетінін растадық. (1b-сурет) αS:pLK молярлық қатынасының жоғарылауы жағдайында 13C/15N таңбаланған αS пайдалану.pLK-ның αS-тің Ct-доменімен әрекеттесуі химиялық ығысудың бұзылыстарында және белоктың осы аймағындағы ең жоғары қарқындылықтың төмендеуінде көрінеді.Бір қызығы, біз шамамен αS концентрациясында αS-ті pLK-мен араластырған кезде.5–25 мкМ полиэтиленгликоль (5–15% PEG-8) қатысуымен (типтік LLPS буфері: 10 мМ HEPES pH 7,4, 100 мМ NaCl, 15% PEG-8) біз бірден белок түзілудің кең өрісінен өттік. .тамшылар флуоресценция (WF) және жарқын өріс (BF) микроскопиясының көмегімен байқалды (Cурет 1c).Құрамында концентрацияланған αS бар 1-5 мкм тамшылар (қосылған 1 мкМ AlexaFluor488 таңбаланған αS, AF488-αS), олардың электростатикалық қасиеттері олардың 10% 1,6-гександиолға (1,6-HD) төзімділігінен және оның сезімталдығынан алынуы мүмкін. NaCl концентрациясының жоғарылауы (1c-сурет).αS/pLK электростатикалық кешенінің коацерваттарының сұйықтық тәрізді табиғаты олардың миллисекундтар ішінде балқыту қабілетімен көрсетілген (1d-сурет).Турбидиметрияны қолдана отырып, біз осы жағдайларда тамшылардың пайда болуын сандық түрде анықтадық, оның тұрақтылығымен байланысты негізгі өзара әрекеттесудің электростатикалық сипатын растадық (1е-сурет) және әртүрлі полимер қатынастарының LLPS процесіне әсерін бағаладық (1f-сурет).Тамшылардың түзілуі полимер арақатынасының кең диапазонында байқалғанымен, pLK αS артық болғанда процесс өте қолайлы.Сондай-ақ ЖШС-тер химиялық әртүрлі ығыстырушы агент декстран-70 (70 кДа) немесе әртүрлі үлгі форматтарын, соның ішінде шыны сырғымалы тамшыларды, әртүрлі материалдардан жасалған микропластиналық ұңғымаларды, Эппендорф немесе кварц капиллярларын қолдану арқылы да байқалды.
а Осы зерттеуде пайдаланылған WT-αS және ΔCt-αS нұсқаларындағы әртүрлі ақуыз аймақтарының схемалық көрінісі.Амфипатикалық N-терминал домені, гидрофобты амилоид түзетін (NAC) аймақ және теріс зарядталған С-терминал домені сәйкесінше көк, қызғылт сары және қызыл түстермен көрсетілген.WT-αS таза заряды (NCPR) картасы көрсетілген.b Макромолекулалық түйіндер болмаған кезде αS/pLK әрекеттесуінің ЯМР талдауы.pLK концентрациясы артқан сайын (αS:pLK молярлық қатынасы 1:0,5, 1:1,5 және 1:10 сәйкесінше ашық жасыл, жасыл және қою жасыл түспен көрсетілген).c LLPS буферінде (жоғарғы) немесе 500 мМ NaCl немесе одан кейін (сол жақта) толықтырылған αS/pLK (молярлық қатынасы 1:10) 25 мкм (WF кескіні үшін 1 мкМ AF488 таңбаланған αS немесе Atto647N таңбаланған pLK) коасерваттаңыз % 1,6-гександиол (1,6-HD; төменгі оң жақта).Масштаб жолағы = 20 мкм.d 25 мкМ концентрациядағы αS/pLK (молярлық қатынасы 1:10) BF тамшыларының синтезінің репрезентативті микроскопиялық суреттері;көрсеткілер жеке тамшылардың (қызыл және сары көрсеткілер) 200 мс ішінде жаңа тамшыға (қызғылт сары көрсеткі) қосылуын көрсетеді) .Масштаб жолағы = 20 мкм.e Жарық шашырауы (350 нм кезінде) 500 мМ NaCl немесе 25 мМ αS кезінде 10% 1,6-HD қосқанға дейін және одан кейін LLPS буферіндегі αS/pLK агрегациясы (N = 3 үлгі көшірмелері, орташа және стандартты ауытқу да көрсетілген).f BF кескіні (жоғарғы) және αS/pLK агрегациясының 25 мкМ αS кезінде αS:pLK молярлық қатынасының артуымен (N = 3 үлгі көшірмелері, орташа және стандартты ауытқу да көрсетілген) αS/pLK агрегациясының (350 нм, төменгі) талдауы.Масштаб жолағы = 10 мкм.Бір суреттегі масштабтау жолағы бір панельдегі барлық кескіндердің масштабын көрсетеді.Шикі деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
αS/pLK электростатикалық кешен конденсациясын бақылауларымызға және tau31-мен тікелей әрекеттесу арқылы tau/РНҚ конденсатының клиенттік молекуласы ретінде αS алдыңғы бақылауларымызға сүйене отырып, біз αS және tau РНҚ болмаған кезде еріткішпен бірге бөлінуі мүмкін деп болжадық. конденсация.электростатикалық кешендер арқылы, ал αS αS/Tau коацерваттарындағы тірек ақуызы болып табылады (2e суретіндегі тау зарядының таралуын қараңыз).LLPS буферінде 10 мкм αS және 10 мкМ Tau441 (тиісінше 1 мкм AF488-αS және 1 мкМ Atto647N-Tau бар) араласқанда, WF микроскопиясы арқылы көрінетіндей, олар екі ақуызды қамтитын ақуыз агрегаттарын оңай түзетінін байқадық.(2а-сурет).Тамшылардағы екі ақуыздың коллокализациясы конфокальды (CF) микроскопиямен расталды (Қосымша 1а-сурет).Ұқсас мінез-құлық декстран-70 агрегация агенті ретінде пайдаланылған кезде байқалды (Қосымша 1c сурет).FITC таңбаланған PEG немесе декстранды пайдалана отырып, біз жинақтаушы агенттердің екеуі де үлгілер бойынша біркелкі бөлінгенін анықтадық, бұл сегрегацияны да, ассоциацияны да көрсетпейді (қосымша 1d сурет).Керісінше, бұл жүйеде олар макромолекулярлық толып кету әсерлері арқылы фазалардың бөлінуіне ықпал етеді деп болжайды, өйткені PEG басқа ЖШС жүйелерінде көрінетіндей тұрақты тығыздаушы агент болып табылады33,34.Бұл ақуызға бай тамшылар NaCl (1 М) сезімтал болды, бірақ 1,6-HD (10% v/v) емес, олардың электростатикалық қасиеттерін растайды (Қосымша 2a, b сурет).Олардың сұйық мінез-құлқы BF микроскопиясының көмегімен миллисекундтық біріктірілген тамшылар оқиғаларын бақылау арқылы расталды (2б-сурет).
a LLPS буферіндегі αS/Tau441 коацерваттарының конфокальды (CF) микроскопиялық суреттері (әр ақуыздың 10 мкм, AF488 таңбаланған αS және Atto647N таңбаланған Tau441 0,5 мкм).b αS/Tau441 тамшыларын біріктіру оқиғаларының репрезентативті дифференциалды кедергі контрастын (DIC) кескіндері (әр ақуыз үшін 10 мкм).c Tau441 LLPS (0–15 мкм) 50 мкМ αS жоқ (сол жақта) немесе бар (оң жақта) кезіндегі жарық шашырауына (350 нм кезінде) негізделген фазалық диаграмма.Жылы түстер көбірек шашырауды көрсетеді.d αS концентрациясының жоғарылауымен αS/Tau441 LLPS үлгілерінің жарық шашырауы (5 мкМ кезінде Tau441, көрсетілгендей N = 2–3 үлгінің қайталануы).e Осы зерттеуде пайдаланылған ақуыздың кейбір тау ақуыз нұсқаларының және әртүрлі аймақтарының схемалық көрінісі: теріс зарядталған N-терминал домені (қызыл), пролинге бай аймақ (көк), микротүтіктерді байланыстыратын домен (MTBD, қызғылт сары түспен белгіленген) және амилоид түзетін жұп спираль.MTBD (сұр) ішінде орналасқан жіп аймақтары (PHF).Tau441 құрылғысының таза төлем (NCPR) картасы көрсетілген.f ΔNt-Tau (жоғарғы жағында, әр ақуызға 10 мкМ) немесе K18 (төменгі, әрбір μM5 ақуыз) қатысуымен 1 мкМ AF488 таңбаланған αS және Atto647N таңбаланған ΔNt-, 1 мкМ AF488 таңбаланған αS немесе ΔCt-αS пайдалану ) ) LLPS немесе K18 буферінде конденсацияланған WF микросуреттері.Бір суреттегі масштаб жолақтары бір панельдегі барлық кескіндердің масштабын білдіреді (a, b және f панельдері үшін 20 мкм).c және d панеліне арналған өңделмеген деректер өңделмеген деректер файлдары ретінде беріледі.
Осы LLPS процесінде αS рөлін тексеру үшін біз алдымен NaCl концентрациясын жоғарылату арқылы нефелометрия арқылы αS тамшылардың тұрақтылығына әсерін зерттедік (Cурет 2c).Құрамында αS бар үлгілердегі тұз концентрациясы неғұрлым жоғары болса, жарықтың шашырау мәндері соғұрлым жоғары болады (350 нм кезінде), бұл осы LLPS жүйесіндегі αS тұрақтандырғыш рөлін көрсетеді.Ұқсас әсерді αS концентрациясын (демек, αS:Tau441 қатынасын) шамамен ұлғайту арқылы байқауға болады.тау концентрациясына (5 мкМ) қатысты 10 есе жоғарылау (2d-сурет).αS коацерваттардағы тірек протеині екенін көрсету үшін біз ΔNt-Tau деп аталатын теріс зарядталған N-терминал аймағы (қалдықтар 1-150, 2e суретін қараңыз) жоқ LLPS-бұзылған Тау мутантының мінез-құлқын зерттеуді шештік.WF микроскопиясы және нефелометрия ΔNt-Tau-ның өзі LLPS-тен өтпегенін растады (2f-сурет және Қосымша 2d-сурет), бұрын хабарланғандай 14. Алайда, αS осы қысқартылған Тау нұсқасының дисперсиялық ерітінділеріне қосылғанда, LLPS процесі толығымен болды. ұқсас жағдайларда және ақуыз концентрациясында Tau және αS толық өлшемді ерітінділерінің тамшы тығыздығына жақын тамшылардың тығыздығымен қалпына келтірілді.Бұл процесті төмен макромолекулалық толып кету жағдайында да байқауға болады (Қосымша 2c сурет).LLPS процесіндегі C-терминалының αS аймағының рөлі, бірақ оның бүкіл ұзындығы емес, (ΔCt-) 104-140 қалдықтары жоқ (1а-сурет) C-терминалының кесілген αS нұсқасын пайдаланып тамшылардың түзілуін тежеу ​​арқылы көрсетілді. αS) ақуыз (2f-сурет және қосымша 2d-сурет).αS және ΔNt-Tau коллокализациясы конфокальды флуоресцентті микроскопиямен расталды (қосымша 1b-сурет).
Tau441 және αS арасындағы LLPS механизмін әрі қарай сынау үшін қосымша Tau нұсқасы пайдаланылды, атап айтқанда, микротүтіктерді байланыстыратын домендегі (MTBD) жұпталған спиральді жіп өзегі (PHF) фрагменті, егер ол төрт тән қайталанатын доменді қамтыса, әдетте белгілі K18 фрагменті ретінде (2e-суретті қараңыз).Жақында αS пролинге бай доменде орналасқан тау протеинімен микротүтікшелерді байланыстыратын доменнен бұрын болатын реттілікпен байланысатыны туралы хабарланды.Дегенмен, PHF аймағы оң зарядталған қалдықтарға да бай (2e суретін қараңыз), әсіресе лизинге (15% қалдық), бұл бізді бұл аймақтың αS/Tau кешенінің конденсациясына да ықпал ететінін тексеруге итермеледі.Біз тек K18 сыналған шарттарда (15% PEG немесе 20% декстраны бар LLPS буфері) 100 мкМ дейінгі концентрацияларда LLPS-ті қоздыра алмайтынын байқадық (2f-сурет).Дегенмен, 50 мкМ αS-ті 50 мкМ K18-ге қосқанда, нефелометрия (қосымша 2d-сурет) және WF микроскопиясы (2f-сурет) арқылы құрамында K18 және αS бар ақуыз тамшыларының жылдам түзілуі байқалды.Күтілгендей, ΔCt-αS K18 LLPS әрекетін қалпына келтіре алмады (2f-сурет).αS/K18 агрегациясы αS/ΔNt-Tau немесе αS/Tau441-мен салыстырғанда LLPS индукциясы үшін ақуыз концентрациясының сәл жоғарырақ болуын қажет ететінін ескереміз, басқалары тең.Бұл бұрын сипатталғандай αS C-терминал аймағының пролинге бай Тау доменімен микротүтіктерді байланыстыратын доменмен салыстырғанда күштірек әрекеттесуіне сәйкес келеді 31 .
ΔNt-Tau αS болмаған кезде LLPS орындай алмайтынын ескере отырып, толық ұзындықтағы Tau (изотипі, Tau441/Tau441) бар LLPS жүйелеріндегі қарапайымдылығын ескере отырып, αS/Tau LLPS сипаттау үлгісі ретінде осы Tau нұсқасын таңдадық.күрделі (гетеротиптік, αS/Tau441) агрегация процестерімен.Біз αS/Tau және αS/ΔNt-Tau жүйелеріндегі αS агрегациясының дәрежесін (конденсацияланған фазалық ақуыздың бөлігі ретінде, fαS,c) центрифугалау және дисперсті фазалық SDS-PAGE талдауы арқылы салыстырдық (2e қараңыз), өте ұқсас мәндер табылды. бірдей концентрациядағы барлық белоктар үшін.Атап айтқанда, біз αS/Tau және αS/ΔNt-Tau үшін сәйкесінше fαS,c 84 ± 2% және 79 ± 7% алдық, бұл αS және tau арасындағы гетеротиптік әрекеттесу tau молекулалары арасындағы әрекеттесуден жоғары екенін көрсетті.арасында.
Әртүрлі поликатиондармен әрекеттесу және конденсация процесінің αS кинетикасына әсері алдымен фотоағарту (FRAP) әдісімен флуоресценцияны қалпына келтіру арқылы зерттелді.Біз αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau және αS/pLK коацерваттарын (2 мкм αS AF488-αS және 100 мкм Tau441 немесе ΔNt-Tau немесе 1 mM pLK толықтырылған 100 мкМ αS) сынадық.Деректер үлгі компоненттерін араластырғаннан кейін алғашқы 30 минут ішінде алынды.Өкілдік FRAP кескіндерінен (3a-сурет, αS/Tau441 конденсациясы) және олардың сәйкес уақыт курсының қисықтарынан (3b-сурет, Қосымша сурет 3), αS кинетикасының Tau441 коацерваттарына өте ұқсас екенін көруге болады.және ΔNt-Tau, бұл pLK көмегімен әлдеқайда жылдам.FRAP бойынша коацерват ішіндегі αS үшін есептелген диффузия коэффициенттері (Kang және т.б. 35 сипаттағандай) αS/Tau441 және α-S/Δt үшін D = 0,013 ± 0,009 мкм2/с және D = 0,026 ± 0,008 мкм2/с. αS/ жүйесі.pLK, Tau және D = 0,18 ± 0,04 мкм2/с тиісінше (Cурет 3c).Дегенмен, дисперсті фазадағы αS диффузия коэффициенті бірдей шарттарда (LLPS буфері), бірақ поликатиондар болмаған кезде флуоресценциялық корреляция спектроскопиясы (FCS, Қосымша 3-суретті қараңыз) арқылы анықталғандай, барлық конденсацияланған фазалардан бірнеше рет жоғары. (D = 8 ± 4 мкм2/с).Демек, αS трансляциясының кинетикасы коацерваттарда дисперсті фазадағы белоктармен салыстырғанда айқын молекулалық толып кету әсерлерінен айтарлықтай төмендейді, дегенмен барлық коацерваттар тау фазасынан айырмашылығы олар түзілгеннен кейін бірінші жарты сағат ішінде сұйықтық тәрізді қасиеттерді сақтайды.pLK конденсатындағы жылдамырақ кинетика.
a–c электростатикалық коацерваттардағы αS динамикасының (2% AF488 таңбаланған αS) FRAP талдауы.αS/Tau441 FRAP талдауларының үш данада репрезентативті кескіндері (a) көрсетілген, мұнда қызыл шеңберлер түссізденген аумақтарды көрсетеді.Масштаб жолағы 5 мкм.b Орташа FRAP қисықтары және (c) 100 мкМ αS және Tau441 (қызыл) немесе ΔNt-Tau (көк) немесе pLK (жасыл) эквимолярлық концентрацияларын пайдаланатын үш тәжірибеден алынған 5–6 (N) әртүрлі тамшылар үшін есептелген диффузия коэффициенттері (D) LLPS концентрациясынан он есе жоғары.FRAP қисығының стандартты ауытқуы көлеңкеленген түспен көрсетілген.Салыстыру үшін дисперсті фазадағы диффузия коэффициенті αS флуоресценциялық корреляциялық спектроскопия (FCS) көмегімен үш данамен анықталды (қосымша ақпарат алу үшін 3-суретті және әдістерді қараңыз).d Ешбір поликациясыз (қара) немесе 100 мкМ Tau441 (қызыл) немесе ΔNt-Tau (көк) немесе 1 мМ pLK (жасыл) болған кезде LLPS буферіндегі 100 мкм TEMPOL-122-αS үздіксіз X диапазонындағы EPR спектрлері.Кірістіру ең күрт өзгерістер орын алатын күшті өріс сызықтарының үлкейтілген көрінісін көрсетеді.e LLPS болмаған кезде әртүрлі поликатиондары бар 50 мкМ TEMPOL-122-αS байланыстыру қисықтары (PEG жоқ).Нормаланған EPR спектрінің II (IIII/III) жолағымен салыстырғанда III жолақ амплитудасының төмендегені Tau441 (қызыл), ΔNt-Tau (көк) және pLK (жасыл) молярлық қатынасын жоғарылататыны көрсетілген.Түрлі-түсті сызықтар әр қисық сызықта n бірдей және тәуелсіз байланыстыру орны бар өрескел байланыстыру үлгісін пайдаланып деректерге сәйкестігін көрсетеді.Шикі деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Қосымша ретінде біз бағытталған айналдыру таңбалауы (SDSL) және үздіксіз электрондық парамагниттік резонанс (CW-EPR) арқылы әртүрлі коацерваттардағы αS динамикасын зерттедік.Бұл әдіс нақты қалдық ажыратымдылығы бар IDP икемділігі мен динамикасын хабарлауда өте пайдалы екенін дәлелдеді36,37,38.Осы мақсатта біз жалғыз Cys мутанттарында цистеин қалдықтарын құрастырдық және 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) спиндік зондын қолдандық.Малеймид туындылары оларды белгілейді.Нақтырақ айтқанда, біз TEMPOL зондтарын 122 немесе 24 αS (TEMPOL-122-αS және TEMPOL-24-αS) позициясына енгіздік.Бірінші жағдайда біз поликатиондармен әрекеттесуге қатысатын ақуыздың С-терминал аймағын нысанаға аламыз.Оның орнына 24-позиция конденсаттағы ақуыздардың жалпы динамикасы туралы ақпарат бере алады.Екі жағдайда да дисперсті фаза ақуыздары үшін алынған ЭПР сигналдары жылдам қозғалатын күйдегі нитроксидтік радикалдарға сәйкес болды.Тау немесе pLK (100 мкМ TEMPOL-αS, Tau441 немесе ΔNt-Tau 1:1 қатынасында немесе pLK 1:10 қатынасында) қатысуымен фазалық бөлінуден кейін салыстырмалы шыңның қарқындылығының жоғарылауы байқалды. αS EPR спектрі.Жоғалту сызығы кеңейді, бұл сұйылтылған фазадағы ақуызмен салыстырғанда тамшылардағы αS қайта бағдарлану кинетикасының төмендегенін көрсетеді (3d-сурет, Қосымша 4a-сурет).Бұл өзгерістер 122-позицияда айқынырақ болады. 24-позицияда pLK болуы зонд кинетикасына әсер етпесе, 122-позицияда спектрлік сызықтың пішіні айтарлықтай өзгерді (Қосымша 4a-сурет).Спинмен белгіленген IDP38,39 динамикасын сипаттау үшін әдетте қолданылатын изотропты модельді (қосымша 5a сурет) пайдаланып екі αS/поликация жүйесінің 122-позициясындағы спектрлерді модельдеуге әрекет жасағанда, эксперименттік спектрлерді қайта құру мүмкін болмады..24 айналу контрастының позициясын спектрлік модельдеу (қосымша 5а-сурет).Бұл поликатиондар болған кезде αS-тің С-терминал аймағының спиндік конфигурациялар кеңістігінде артықшылықты позициялар бар екенін көрсетеді.Эксперименттік EPR жағдайында конденсацияланған фазадағы αS үлесін қарастырған кезде (84 ± 2%, 79 ± 7% және αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau және αS/pLK үшін тиісінше 47 ± 4% — Қосымшаны қараңыз. Деректер талдауының 2e суреті c), EPR әдісімен анықталған кеңею негізінен конденсацияланған фазадағы әртүрлі поликатиондармен αS-тің С-терминал аймағының өзара әрекеттесуін көрсететінін көруге болады (TEMPOL-122- пайдалану кезіндегі негізгі өзгеріс αS), белок конденсациясы емес.Зондта микротұтқырлықтың жоғарылауы байқалады.Күтілгендей, қоспаға 1 M NaCl қосылғанда, LLPS-тен басқа жағдайларда ақуыздың EPR спектрі толығымен қалпына келтірілді (қосымша сурет 4b).Жалпы алғанда, біздің деректеріміз CW-EPR анықтаған өзгерістер негізінен αS-тің С-терминал аймағының конденсацияланған фазадағы әртүрлі поликатиондармен әрекеттесуін көрсетеді және бұл өзара әрекеттесу Tau-ға қарағанда pLK-мен күштірек болып көрінеді.
Коацерваттағы ақуыздар туралы көбірек құрылымдық ақпаратты алу үшін біз ерітіндідегі ЯМР көмегімен LLPS жүйесін зерттеуді шештік.Дегенмен, біз дисперсті фазада қалған αS фракциясын ғана анықтай алдық, бұл коацерват ішіндегі ақуыз динамикасының төмендеуіне және ЯМР талдауында ерітіндінің төменгі жағындағы тығыз фазаға байланысты болуы мүмкін.Біз NMR көмегімен LLPS үлгісінің дисперсті фазасында қалған ақуыздың құрылымы мен динамикасын талдағанда (қосымша сурет 5c, d), біз ақуыздың pLK және ΔNt-Tau қатысуымен бірдей дерлік әрекет ететінін байқадық. Екіншілік химиялық ығысу және R1ρ релаксациясы бойынша тәжірибелер арқылы анықталған ақуыз омыртқасының екінші реттік құрылымы мен динамикасында болатын.ЯМР деректері көрсеткендей, αS-тің С-терминусы поликатиондармен өзара әрекеттесуіне байланысты белок тізбегінің қалған бөлігі сияқты өзінің ретсіз сипатын сақтай отырып, конформациялық икемділігін айтарлықтай жоғалтады.
TEMPOL-122-αS конденсацияланған фазасында байқалған CW-EPR сигналының кеңеюі белоктың поликатиондармен әрекеттесуін көрсететіндіктен, LLPS болмаған кезде αS-тің әртүрлі поликатиондарға байланысуын бағалау үшін EPR титрлеуін жасадық (жинақталмаған Буфер LLPS), сұйылтылған және концентрленген фазалардағы өзара әрекеттесулердің бірдей екенін болжайды (бұл біздің деректермен расталады, Қосымша 4a-сурет және Қосымша 6-сурет).Мақсаты барлық коацерваттардың жалпы сұйықтыққа ұқсас қасиеттеріне қарамастан, молекулалық деңгейде қандай да бір негізгі дифференциалды мінез-құлықты көрсететінін көру болды.Күтілгендей, EPR спектрі поликация концентрациясының жоғарылауымен кеңейді, бұл барлық өзара әрекеттесу серіктестерінің молекулалық өзара әрекеттесуіне байланысты молекулалық икемділіктің азаюын көрсетеді (3e-сурет, Қосымша 6-сурет).pLK бұл қанығуға ΔNt-Tau және Tau441 салыстырғанда төмен молярлық қатынаста (поликация:αS) қол жеткізді.Шындығында, n бірдей және тәуелсіз байланыстыру учаскелерін болжайтын деректерді шамамен байланыстыру моделімен салыстыру pLK (~5 мкм) көрінетін диссоциация константасы Tau441 немесе ΔNt-Tau (~50 мкМ) шамасынан төменірек мән екенін көрсетті. ).µM).Бұл дөрекі бағалау болса да, бұл αS үздіксіз оң заряд аймақтары бар қарапайым поликатиондарға жоғары жақындығы бар екенін көрсетеді.αS және әртүрлі поликатиондар арасындағы ұқсастықтағы бұл айырмашылықты ескере отырып, біз олардың сұйық қасиеттері уақыт өте әртүрлі өзгеруі мүмкін және осылайша әртүрлі LSPT процестерінен зардап шегеді деп болжадық.
Протеин коацерватындағы өте тығыз ортаны және ақуыздың амилоидты табиғатын ескере отырып, біз ықтимал LSPT процестерін анықтау үшін уақыт өте келе коацерваттың әрекетін бақыладық.BF және CF микроскопиясын қолдана отырып (4-сурет) біз αS/Tau441 ерітіндіде үлкен дәрежеде коацерват болатынын байқадық, бұл үлкен тамшыларды қалыптастырады және ұңғыманың/сырғыманың түбіндегі бетін күткендей толық тамшылар ретінде сулайды (Қосымша сурет). 7d);біз бұл түбінен түзілген құрылымдарды «белок салдары» деп атаймыз.Бұл құрылымдар сұйық күйінде қалды, өйткені олар балқыту қабілетін сақтайды (Қосымша 7b-сурет) және LLPS іске қосылғаннан кейін бірнеше сағат бойы көрінуі мүмкін (4-сурет және Қосымша 7c-сурет).Теңгерімсіз зарядтары бар электростатикалық коацерваттар үшін және осылайша жоғары электростатикалық беттік потенциалдар үшін күткендей, ылғалдандыру процесі гидрофобты емес материалдардың бетінде қолайлы екенін байқадық (Қосымша 7а сурет).Атап айтқанда, αS/ΔNt-Tau коалесценциясы мен рафтинг айтарлықтай төмендеді, ал αS/pLK конденсаттары айтарлықтай төмендеді (4-сурет).Қысқа инкубация уақытында αS/pLK тамшылары біріктіріліп, гидрофильді бетті ылғалдай алды, бірақ бұл процесс тез тоқтады және 5 сағат инкубациядан кейін тек шектелген коалесценция оқиғалары және сулану байқалмады.– гель-тамшы өту.
LLPS буферінде 100 мкМ Tau441 (жоғарғы) микроскопиялық кескіндер)ΔN бар 100 мкМ αS (1% флуоресцентті жапсырма) бар коацерват үлгілерінің BF (сұр реңкті панельдер) және CF (оң жақ панельдер, AF488 таңбаланған αS жасыл) -Тау (орталық) немесе 1 мМ pLK (төменгі жағында) әртүрлі инкубация уақытында және фокустық биіктікте (z, пластина ұңғысының түбінен қашықтық).Тәжірибелер бірдей нәтижелермен бір-бірінен тәуелсіз 4-6 рет қайталанды.αS/Tau441 коацерваттары 24 сағаттан кейін суланып, суреттен үлкенірек салдарды құрайды.Барлық кескіндер үшін масштабтау жолағы 20 мкм.
Содан кейін біз αS/Tau441 LLPS-те түзілген үлкен сұйықтық тәрізді ақуыздық бассейндер зерттелген ақуыздардың кез келгенінің амилоидты агрегациясына әкелетінін сұрадық.Біз αS/Tau441 тамшыларының уақыт өте келе жетілуін WF микроскопиясы арқылы жоғарыдағыдай шарттарда бақылап отырдық, бірақ 1 мкм AF488 таңбаланған αS және Atto647N таңбаланған Tau441 (сурет 5a) қолдандық.Күтілгендей, біз пісіп-жетілу процесінде ақуыздың толық локализациясын байқадық.Бір қызығы, шамамен.5 сағаттан кейін салдардың ішінде біз «нүктелер» деп атайтын, кейбіреулері αS-пен колокализацияланған, ал кейбіреулері Тау441-де байытылған дөңгелек емес құрылымдар байқалды (5а-сурет, ақ көрсеткілер).Бұл дақтар әрқашан αS/ΔNt-Тауға қарағанда αS/ΔNt-Tau үшін көбірек дәрежеде салдарда байқалды.pLK және Tau жүйелерінің тамшыларында біріктіруге/сулануға жарамсыз айқын дақтар болмады.Құрамында αS және Tau441 бар бұл дақтардың амилоид тәрізді агрегаттар екенін тексеру үшін біз Tau441 Atto647N белгісімен таңбаланған және басынан бастап 12,5 мкм амилоидқа тән тиофлавин-Т (ThT) қосылған CF микроскопиясын пайдаланып ұқсас эксперимент жасадық.бояу.αS/Tau441 тамшыларының немесе салдардың ThT-бояуы тіпті 24 сағат инкубациядан кейін де байқалмаса да (5b-сурет, жоғарғы қатар — ақуызды салдар үстіндегі қалған тамшылар), салдар ішінде Atto647N-Tau441 бар ThT-оң құрылымдар өте әлсіз болды.бұл бұрын сипатталған дақтардың өлшемін, пішінін және орналасуын қайталайды (5б-сурет, ортаңғы және төменгі жолдар), бұл дақтар қартаю сұйықтығының коацерваттарында түзілген амилоид тәрізді агрегаттарға сәйкес келуі мүмкін екенін көрсетеді.
WF 25 μM αS әр түрлі инкубация уақытында және фокустық биіктікте (z, байланыспаған түбінен арақашықтық) LLPS буфері бар микроскоп тақтасының шұңқырында 25 мкм Tau441 (1 мкм AF488 таңбаланған αS және Atto647N таңбаланған Tau441) болған кезде) .Алты тәжірибе ұқсас нәтижелермен тәуелсіз қайталанды.b 25 мкм Tau441 (1 мкм Atto647N таңбаланған Tau441) және 12,5 мкм тиофлавин-Т (ThT) болған кезде 25 мкм αS CF микроскопиялық кескіні.Сәйкесінше жоғарғы және ортаңғы жолдарда өлшенген ақуыз тамшылары және тұндырылған ақуыз салдары мен дақтар көрсетілген.Төменгі қатарда 3 тәуелсіз көшірмедегі салдар мен тамшылардың суреттері көрсетілген.Ақ көрсеткілер екі панельдегі ThT-оң нүктелерді көрсетеді.Барлық кескіндер үшін масштабтау жолағы 20 мкм.
Сұйықтан қатты күйге көшу кезінде коацерват протеин желісіндегі өзгерістерді толығырақ зерттеу үшін біз флуоресцентті өмір бойы бейнелеуін (FLIM) және Форстер резонансты энергия тасымалдау микроскопиясын (FRET) қолдандық (6-сурет және қосымша 8 және 9-суреттер).Біз қабаттың конденсацияланған немесе тіпті қатты тәріздес агрегацияланған ақуыз құрылымына коацерваттың жетілуі белок пен оған бекітілген флуоресцентті зондтың арасындағы тығыз байланысқа әкеледі, бұл зондтың қысқартылған қызмет ету уақытында (τ) көрінетін сөндіргіш әсерін тудыруы мүмкін деп болжадық. , бұрын сипатталғандай40.,41 ,42.Сонымен қатар, қос таңбаланған үлгілер үшін (тиісінше FRET доноры және акцепторлық бояғыштары ретінде AF488 және Atto647N) τ-нің бұл төмендеуі сонымен қатар коацерват конденсациясымен және LSPT кезінде FRET(E) тиімділігінің жоғарылауымен қатар жүруі мүмкін.Біз LLPS αS/Tau441 және αS/ΔNt-Tau үлгілерінде уақыт ішінде сал мен дақтардың түзілуін бақыладық (тау441 немесе ΔNt-Tau таңбаланған αS және/немесе Atto647N таңбаланған 1 мкМ AF488 бар LLPS буферіндегі әрбір ақуыздың 25 мкм).Біз AF488 (τ488) және Atto647N (τ647N) зондтарының флуоресценцияның қызмет ету мерзімі коацерваттар пісіп-жетілген сайын аздап төмендейтінін байқадық (6-сурет және қосымша 8c-сурет).Бір қызығы, бұл өзгеріс салдардағы нүктелер үшін айтарлықтай жақсарды (Cурет 6c), бұл нүктелерде одан әрі ақуыз конденсациясының орын алғанын көрсетеді.Мұны растау үшін 24 сағат бойы αS/ΔNt-Tau тамшылары үшін флуоресценцияның қызмет ету уақытында айтарлықтай өзгеріс байқалмады (Қосымша 8d сурет), бұл тамшылардың гельденуі дақтанудан ерекшеленетін процесс және ол айтарлықтай молекулалық қайта құрылымдаумен бірге жүрмейтінін көрсетеді. коацерваттардың ішінде.Нүктелердің αS ішінде, әсіресе αS/Tau441 жүйесінде әртүрлі өлшемдері мен айнымалы мазмұны бар екенін атап өткен жөн (Қосымша 8e-сурет).Нақты флуоресценцияның қызмет ету мерзімінің төмендеуі, әсіресе Tau441 деп белгіленген Atto647N үшін (қосымша сурет 8a) қарқындылықтың жоғарылауымен және αS/Tau441 және αS/ΔNt-Tau жүйелері үшін жоғарырақ FRET тиімділігімен қатар жүрді, бұл LLPS ішінде бес сағаттық конденсацияны көрсетеді. іске қосқаннан кейін статикалық электр ішіндегі ақуыздар конденсацияланды.αS/ΔNt-Tau-мен салыстырғанда, біз αS/Tau441 нүктелерінде τ647N төмен және біршама жоғары τ488 мәндерін байқадық, бұл төмен және біртекті емес FRET мәндерімен бірге жүреді.Мүмкін, бұл αS/Tau441 жүйесінде агрегаттардағы байқалатын және күтілетін αS көптігі Таумен салыстырғанда гетерогенді, көбінесе субстоихиометриялық болуымен байланысты болуы мүмкін, өйткені Tau441 өзі де LLPS және агрегациядан өтуі мүмкін (Қосымша 8e сурет) .Дегенмен, Tau441 де, αS да болған кезде тамшылардың бірігуі, салдардың түзілу дәрежесі және, ең бастысы, сұйықтық тәрізді коацерваттардағы ақуыз агрегациясы максималды болады.
αS/Tau441 және αS/ΔNt-Tau өмірлік флуоресцентті микроскопияның (FLIM) суреттері ішіндегі әрбір ақуыздың 25 мкм (1 мкм AF488 таңбаланған αS және 1 мкм Atto647N таңбаланған Tau441 немесе ΔNt-PSLL буфері) кезінде.Бағандарда LLPS үлгілерінің әртүрлі жетілу уақыттарында (30 мин, 5 сағ және 24 сағат) репрезентативті кескіндері көрсетілген.Қызыл жақтауда αS/Tau441 дақтары бар аймақ көрсетілген.Өмір сүру ұзақтығы түсті жолақтар ретінде көрсетілген.Масштаб жолағы = барлық кескіндер үшін 20 мкм.b А панеліндегі қызыл жолақта көрсетілген таңдалған аймақтың үлкейтілген FLIM кескіні.Өмірлік ауқымдар a панеліндегі сияқты бірдей түс шкаласы арқылы көрсетіледі.Масштаб жолағы = 5 мкм.c Tau441 және αS- үшін жазылған FLIM кескіндерінде анықталған әртүрлі ақуыз түрлеріне (тамшылар-D-, сал-R- және дақ-P) арналған AF488 (αS-ке тіркелген) немесе Atto647N (Tau-ға тіркелген) көрсететін гистограммалар αS/ΔNt-Tau коацерват үлгілері (D үшін N = 17-32 ROI, R үшін 29-44 ROI және ұпайлар үшін 21-51 ROI).Орташа және медиана мәндері сәйкесінше қораптардың ішінде сары квадраттар және қара сызықтар түрінде көрсетілген.Қораптың төменгі және жоғарғы шекаралары тиісінше бірінші және үшінші квартилдерді білдіреді, ал 1,5 еселік квартильаралық диапазондағы (IQR) ең төменгі және ең жоғары мәндер мұртша ретінде көрсетілген.Шектеулер қара гауһар ретінде көрсетілген.Таралу жұптары арасындағы статистикалық маңыздылық тең емес дисперсияларды ескере отырып, екі үлгілік t-тестінің көмегімен анықталды.Екі жақты t-тест p-мәндері салыстырылған деректердің әрбір жұбы үшін жұлдызшалармен көрсетілген (* p-мәні > 0,01, ** p-мәні > 0,001, *** p-мәні > 0,0001, **** p-мәні > 0,00001), ns Елеусіздікті көрсетеді (p-мәні > 0,05).Нақты p мәндері 1-қосымша кестеде берілген, ал бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары ретінде берілген.
Дақтардың/агрегаттардың амилоид тәрізді табиғатын одан әрі көрсету үшін біз (1 М) NaCl жоғары концентрациясы бар боялмаған коацерват үлгілерін 24 сағат бойы өңдедік, нәтижесінде агрегаттар ақуыз коацерваттарынан бөлінді.Оқшауланған агрегаттарды (яғни, агрегаттардың дисперсті ерітіндісін) атомдық күштік микроскопияны (AFM) қолдану арқылы бақылағанда, біз шамамен 15 нм тұрақты биіктігі бар, негізінен сфералық морфологияны байқадық, ол тұздың жоғары концентрациясы жағдайында бірігуге бейім. бетіндегі күшті гидрофобты әсерге байланысты типтік амилоидты фибрилдердің мінез-құлқы (фибрилдердің әдетте ~10 нм биіктігі бар екенін ескеріңіз) (Қосымша 10а-сурет).Бір қызығы, оқшауланған агрегаттар ThT стандартты флуоресценция талдауында ThT инкубацияланған кезде, біз ThT флуоресценциясының кванттық шығымының күрт өсуін байқадық, бұл бояғышты әдеттегі αS амилоидты фибрилдермен инкубациялаған кезде байқалғанмен салыстырылады (қосымша сурет 10b), бұл коацерват агрегаттарында амилоид тәрізді құрылымдар болады..Шындығында, агрегаттар жоғары тұз концентрацияларына төзімді болды, бірақ типтік амилоидты фибрилдер сияқты 4 М гуанидин хлоридіне (GdnHCl) сезімтал болды (Қосымша 10c сурет).
Әрі қарай, біз бір молекулалы флуоресценцияны, ерекше флуоресценциялық корреляцияны/кросс-корреляциялық спектроскопияны (FCS/FCCS) және екі түсті сәйкестікті анықтаудың (TCCD) жарылысты талдауын пайдаланып агрегаттардың құрамын талдадық.Осы мақсатта біз αS және Tau441 (екеуі де 25 мкм) бар 100 мкл LLPS үлгілерінде 1 мкм AF488 таңбаланған αS және 1 мкм Atto647N таңбаланған Tau441 бар 24 сағат инкубациядан кейін түзілген агрегаттарды оқшауладық.Алынған дисперсті агрегат ерітіндісін LLPS және ақуыз арасындағы кез келген ықтимал электростатикалық әрекеттесуді болдырмау үшін бірдей PEG-бос буферді және 1 M NaCl (агрегаттарды коацерваттан бөлу үшін пайдаланылатын бірдей буфер) пайдаланып мономолекулалық күйге дейін сұйылтыңыз.Бір молекуланың уақыт траекториясының мысалын 7а-суреттен көруге болады.FCCS/FCS талдауы (кросс-корреляция, CC және автокорреляция, AC) үлгілерде αS және tau бар агрегаттар көп болатынын көрсетті (7b-суреттегі CC қисығын қараңыз, сол жақ панель) және қалдық мономерлі ақуыздың артық мөлшері пайда болды. сұйылту процесінің нәтижесі (7b суретіндегі айнымалы ток қисықтарын қараңыз, сол жақ панель).Тек мономерлік протеиндер бар үлгілерді пайдалана отырып, бірдей ерітінді жағдайында орындалған бақылау эксперименттері CC қисықтарын көрсетпеді және айнымалы ток қисықтары мономерлік протеиндер күтілетін диффузия коэффициенттеріне ие болатын бір компонентті диффузия моделіне (4-өрнек) жақсы сәйкес келеді (7б-сурет). ), оң жақ панель).Агрегацияланған бөлшектердің диффузиялық коэффициенті 1 мкм2/с-тан аз, ал мономерлі белоктардыкі шамамен 1 мкм2/с.50–100 мкм/с;мәндер ультрадыбыстық αS амилоидты фибрилдері мен мономерлі αS үшін бұрын жарияланған мәндерге ұқсас ерітінді жағдайларында бөлек 44.Біз TCCD жарылыс талдауы бар агрегаттарды талдаған кезде (7c-сурет, жоғарғы панель), біз әрбір оқшауланған агрегатта (αS/Tau гетероагрегаты) анықталған агрегаттардың шамамен 60% αS және tau екеуін де қамтитынын, шамамен 30% тек қана tau, шамамен 10% αS ғана.αS/Tau гетероагрегаттарының стехиометриялық талдауы гетероагрегаттардың көпшілігінің тауда байығанын көрсетті (стехиометрия 0,5-тен төмен, бір агрегаттағы tau молекулаларының орташа саны αS молекулаларынан 4 есе көп), бұл FLIM in situ-да байқалған жұмысымызға сәйкес келеді. эксперименттер..FRET талдауы бұл агрегаттарда екі ақуыздың да бар екенін көрсетті, бірақ бұл жағдайда нақты FRET мәндері маңызды емес, өйткені экспериментте пайдаланылған таңбаланбаған ақуыздың артық болуына байланысты әрбір агрегаттағы флюорофорлардың таралуы кездейсоқ болды.Бір қызығы, біз 45,46 жетілген амилоидты агрегация тапшылығы бар Тау нұсқасын пайдаланып бірдей талдау жасағанда (Қосымша 11a, b-суретті қараңыз), біз αS электростатикалық агрегация бірдей болғанымен (қосымша 11c, d) байқадық. коацерват ішінде агрегаттарды қалыптастыру қабілеті күрт төмендеді және FLIM in situ эксперименттерінде бірнеше нүктелерді анықтады және оқшауланған агрегат үлгілері үшін әлсіз кросс-корреляция қисықтары байқалды.Дегенмен, анықталған агрегаттардың шағын саны үшін (Tau441-дің тек оннан бір бөлігі) біз әрбір агрегаттың осы Tau нұсқасына қарағанда αS байытылғанын байқадық, анықталған агрегаттардың шамамен 50%-ында тек αS молекулалары бар, ал αS артық мөлшерде гетерогенді болды. .агрегаттар (Қосымша 11e-суретті қараңыз), Tau441 жасаған гетерогенді агрегаттардан айырмашылығы (6f-сурет).Бұл тәжірибелердің нәтижелері αS өзі коацерват ішінде tau-мен жинақтауға қабілетті болғанымен, бұл жағдайда тау нуклеациясының қолайлырақ болатынын және алынған амилоид тәрізді агрегаттардың αS және tau формасы ретінде әрекет ете алатынын көрсетті.Алайда, тау-байы ядро ​​түзілгеннен кейін, αS және tau арасындағы гетеротиптік өзара әрекеттесу агрегаттарда tau молекулалары арасындағы гомотиптік әрекеттесулерге қарағанда қолайлы болады;сұйық αS/tau коацерваттарында ақуыз желілерін де байқаймыз.
a αS/Tau441 электростатикалық коацерваттарда түзілген оқшауланған агрегаттардың жеке молекулаларының репрезентативті флуоресцентті уақытша іздері.αS/Tau441 коагрегаттарына сәйкес келетін жарылыстар (көрсетілген шекті мәннен жоғары жарылыстар) үш анықтау арнасында байқалды (тікелей қозудан кейінгі AF488 және Atto647N эмиссиясы, көк және қызыл сызықтар, жанама қозудан кейінгі Atto647N эмиссиясы), FRET, күлгін сызық).b LLPS-тен алынған оқшауланған αS/Tau441 агрегаттарының үлгісінің FCS/FCCS талдауы (сол жақ панель).AF488 және Atto647N үшін автокорреляция (AC) қисықтары сәйкесінше көк және қызыл түспен, ал екі бояғышты қамтитын агрегаттармен байланысты айқаспалы корреляция (CC) қисықтары күлгін түспен көрсетілген.АС қисығы таңбаланған мономерлі және агрегацияланған ақуыз түрлерінің болуын көрсетеді, ал CC қисықтары қос таңбаланған агрегаттардың диффузиясын ғана көрсетеді.Бірдей талдау, бірақ оқшауланған нүктелердегі сияқты бірдей ерітінді жағдайында, тек мономерлі αS және Tau441 бар үлгілер оң жақ панельде басқару элементтері ретінде көрсетілген.c αS/Tau441 электростатикалық коацерваттарда түзілген оқшауланған агрегаттардың жеке молекулаларының флуоресценциялық жарқыл талдауы.Төрт түрлі қайталауда (N = 152) табылған әрбір агрегатқа арналған ақпарат олардың стехиометриясына, S мәндеріне және FRET тиімділігіне (жоғарғы панель, түс жолағы орын алуды көрсетеді) қарсы сызылған.Агрегаттардың үш түрін ажыратуға болады: -αS-тек S~1 және FRET~0 бар агрегаттар, S~0 және FRET~1 бар тек Tau агрегаттары және аралық S және FRET бар гетерогенді Tau/αS агрегаттары. Әрбір гетерогенді агрегатта (N = 100) анықталған екі маркер белоктары төменгі панельде көрсетіледі (түс шкаласы орын алуды көрсетеді).Шикі деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Сұйық ақуыз конденсаттарының уақыт өте келе гель тәрізді немесе қатты құрылымдарға айналуы немесе қартаюы конденсаттың47 бірнеше физиологиялық функцияларына, сондай-ақ амилоидты агрегациядан бұрынғы қалыптан тыс процесс ретінде ауруға қатысы бар 7, 48, 49. Мұнда біз фазаларды бөлуді және мінез-құлықты егжей-тегжейлі зерттейміз.Төмен микромолярлық концентрацияларда және физиологиялық маңызды жағдайларда бақыланатын ортада кездейсоқ поликатиондар болған кезде LSPT αS (αS есептелген физиологиялық концентрациясы >1 μM50 екенін ескеріңіз), LPS типтік термодинамикалық басқарылатын мінез-құлығынан кейін.Физиологиялық рН кезінде жоғары теріс зарядталған С-терминал аймағы бар αS электростатикалық процесс арқылы pLK немесе Tau сияқты жоғары катионды ретсіз пептидтердің қатысуымен LLPS арқылы сулы ерітіндіде ақуызға бай тамшылар түзе алатынын анықтадық. агрегациялық макромолекулалардың қатысуымен күрделі конденсация.Бұл процесс αS аурумен байланысты агрегациямен байланысты әртүрлі поликатионды молекулалармен кездесетін жасушалық ортада тиісті әсерлерге ие болуы мүмкін in vitro және in vivo51,52,53,54.
Көптеген зерттеулерде тамшылардағы ақуыз динамикасы жетілу процесін анықтайтын негізгі факторлардың бірі ретінде қарастырылды55,56.Поликатиондармен электростатикалық αS коацерваттарында жетілу процесі поликатиондармен әрекеттесу күшіне, валенттілікке және осы әрекеттесулердің көптігіне байланысты.Тепе-теңдік теориясы екі сұйық күйдің тепе-теңдік ландшафты LLPS57,58 қозғайтын биополимерлерге бай үлкен тамшының болуын болжайды.Тамшылардың өсуіне Оствальд жетілу59, коалесценция60 немесе дисперсті фазадағы бос мономерді тұтыну арқылы қол жеткізуге болады61.αS және Tau441, ΔNt-Tau немесе pLK үшін ақуыздың көп бөлігі осы зерттеуде пайдаланылған шарттарда конденсатқа шоғырланған.Дегенмен, толық өлшемді тау тамшылары бетінің сулануы кезінде тез біріктірілгенімен, тамшылардың бірігуі және сулануы ΔNt-Tau және pLK үшін қиын болды, бұл осы екі жүйеде сұйықтық қасиеттерінің тез жоғалуын көрсетеді.Біздің FLIM-FRET талдауымызға сәйкес, ескірген pLK және ΔNt-Tau тамшылары бастапқы тамшылар сияқты ақуыз агрегациясының ұқсас дәрежесін (ұқсас флуоресценцияның қызмет ету мерзімі) көрсетті, бұл бастапқы ақуыз желісінің неғұрлым қатаң болса да сақталғанын көрсетеді.
Тәжірибе нәтижелерін келесі үлгіде ұтымды келтіреміз (8-сурет).Бастапқыда уақытша пайда болған тамшылар көбінесе электростатикалық компенсациясыз ақуыз желілері болып табылады және осылайша зарядтардың теңгерімсіздігі аймақтары бар, әсіресе тамшылар интерфейсінде, нәтижесінде жоғары электростатикалық беттік потенциалы бар тамшылар пайда болады.Зарядтың орнын толтыру үшін (әдетте бұл құбылыс валенттіліктің төмендеуі деп аталады) және тамшылардың беткі әлеуетін азайту үшін тамшылар сұйылтылған фазадан жаңа полипептидтерді қамтуы, заряд-заряд әрекеттесуді оңтайландыру үшін ақуыз желілерін қайта ұйымдастыру және басқа тамшылармен әрекеттесуі мүмкін.беттермен (сулау).αS/pLK тамшылары қарапайым белок торының арқасында (тек αS және pLK арасындағы гетеротиптік өзара әрекеттесулер) және ақуыз-ақуыз әрекеттесулеріне көбірек жақындығы арқасында конденсат зарядын тезірек теңестіре алатын сияқты;шынында да, біз бастапқыда түзілген αS/pLK коацерваттарында αS/Tau-ға қарағанда жылдамырақ ақуыз кинетикасын байқадық.Валенттілік азайғаннан кейін өзара әрекеттесулер аз эфемерлі болады және тамшылар сұйық қасиеттерін жоғалтады және электростатикалық беттік потенциалы төмен (сондықтан бетті ылғалдай алмайтын) гель тәрізді, жанбайтын тамшыларға айналады.Керісінше, αS/Tau тамшылары күрделі белок желілеріне (гомотиптік және гетеротиптік өзара әрекеттесулерімен) және ақуыздардың өзара әрекеттесуінің әлсіз сипатына байланысты тамшы зарядының тепе-теңдігін оңтайландыруда тиімділігі төмен.Бұл ұзақ уақыт бойы сұйықтық әрекетін сақтайтын және жоғары электростатикалық беттік потенциалды көрсететін тамшыларға әкеледі, олар біріктіру және өсу (осылайша тамшылардың бетінің ауданы/көлемдік қатынасын азайту) және гидрофильді бетті сулау арқылы азайтылады.Бұл ақуыз желісіндегі зарядты оңтайландыруды үнемі іздеуге байланысты өзара әрекеттесу өте өтпелі болып қалатындықтан, сұйықтық қасиеттерін сақтайтын үлкен концентрацияланған ақуыз кітапханаларын жасайды.Бір қызығы, Таудың N-терминалды кесілген формалары, соның ішінде кейбір табиғи изоформалар62, аралық мінез-құлық көрсетеді, кейбір коацерваттар αS-пен ұзақ өмір сүретін гель тәрізді тамшыларға қартаяды, ал басқалары үлкен сұйық конденсаттарға айналады.αS электростатикалық коацерваттарының пісіп жетілуіндегі бұл екі жақтылық конденсат мөлшері мен сұйықтық қасиеттерін бақылаудың кілті ретінде конденсаттарда валенттілік сарқылуы мен электростатикалық елеуіш арасындағы корреляцияны анықтаған соңғы LLPS теориялық және эксперименттік зерттеулеріне сәйкес келеді.Механизм 58.61.
Бұл схема LLPS және LSPT арқылы αS және Tau441 үшін болжамды амилоидты агрегация жолын көрсетеді.Қосымша анионға бай (қызыл) және катионға бай (көк) аймақтармен қанағаттанарлық валенттілігі бар αS және tau электростатикалық коацерваттардың беттік энергиясы төмен, демек, азырақ бірігуі болады, бұл тамшылардың тез қартаюына әкеледі.Тұрақты агломерацияланбаған гель күйіне қол жеткізіледі..Бұл жағдай αS/pLK жүйесі жағдайында өте қолайлы, себебі оның жоғары жақындығы мен қарапайым белок-жұп әрекеттесу желісі, бұл гель тәрізді жылдам өтуге мүмкіндік береді.Керісінше, қанағаттанарлықсыз валенттілігі бар тамшылар және, демек, өзара әрекеттесу үшін қол жетімді ақуыз-зарядталған аймақтар, коацерваттың жоғары беттік энергиясын азайту үшін гидрофильді бетті балқытуды және ылғалдандыруды жеңілдетеді.Бұл жағдай әлсіз Тау-Тау және αS-Тау әрекеттесулерінен тұратын көпвалентті күрделі желіге ие αS/Tau441 коацерваттары үшін қолайлы.Өз кезегінде, үлкенірек коацерваттар өздерінің сұйықтыққа ұқсас қасиеттерін оңай сақтайды, бұл басқа ақуыз-белок өзара әрекеттесуіне мүмкіндік береді.Сайып келгенде, коацерват сұйықтығының ішінде құрамында αS және тау бар амилоидты гетерогенді агрегаттар түзіледі, олар нейродегенеративті аурулардың белгілері болып табылатын инклюзия денелерінде табылғандарға қатысты болуы мүмкін.
αS/Tau441 пісіп-жетілуі кезінде түзілген үлкен сұйықтық тәрізді құрылымдар, жоғары тоқырау, бірақ динамикалық ақуыз ортасы және аз дәрежеде αS/ΔNt-Tau коацерваттары ақуыз агрегациясының нуклеациясы үшін тамаша резервуарлар болып табылады.Біз шынымен де белок коацерваттарының осы түріндегі қатты ақуыз агрегаттарының түзілуін байқадық, олардың құрамында αS және tau да бар.Біз бұл гетероагрегаттар электростатикалық емес әрекеттесу арқылы тұрақтанатынын, амилоидты-спецификалық ThT бояғыштарын типтік амилоидты фибрилдер сияқты байланыстыра алатынын және шын мәнінде әртүрлі әсерлерге ұқсас тұрақтылыққа ие екенін көрсеттік.LLPS түзетін αS/tau агрегаттарының амилоид тәрізді қасиеттері бар екені көрсетілді.Шынында да, амилоидты агрегацияда жетіспейтін Tau жетілген нұсқасы сұйық электростатикалық коацерват ішінде осы гетерогенді αS агрегаттарының түзілуінде айтарлықтай бұзылады.αS/Tau441 агрегаттарының түзілуі сұйықтық тәрізді қасиеттерді сақтайтын коацерваттардың ішінде ғана байқалды және коацерваттар/тамшылар гельдік күйге жетпесе ешқашан байқалмайды.Соңғы жағдайда электростатикалық әсерлесудің күшеюі және соның нәтижесінде белок желісінің қаттылығы амилоидты нуклеацияға қажетті жаңа ақуыздық әрекеттесулерді орнату үшін белоктардың қажетті конформациялық қайта құрылуын болдырмайды.Дегенмен, бұған икемді, сұйық тәрізді коацерваттарда қол жеткізуге болады, олар өз кезегінде көлемі ұлғайған сайын сұйық болып қалу ықтималдығы жоғары.
Конденсацияланған фаза ішінде агрегаттардың пайда болуы тез гельденетін кішкентай тамшыларға қарағанда, үлкен αS/Tau конденсаттарында қолайлы екендігі тамшылардың бірігуін бақылайтын факторларды анықтаудың өзектілігін көрсетеді.Осылайша, фазалардың бөліну үрдісі ғана емес, конденсаттың дұрыс жұмыс істеуі, сондай-ақ аурудың алдын алу үшін оның мөлшерін бақылау керек58,61.Біздің нәтижелеріміз сонымен қатар αS/Tau жүйесі үшін LLPS және LSPT арасындағы тепе-теңдіктің маңыздылығын көрсетеді.Тамшылардың түзілуі қанықтыру жағдайында қол жетімді ақуыз мономерлерінің мөлшерін азайту арқылы амилоидты агрегациядан қорғай алады, басқа жүйелерде ұсынылғандай63,64, тамшылардың жоғары деңгейлерінде тамшылардың бірігуі баяу конформациялық қайта құрылымдау арқылы ішкі ақуыз агрегациясына әкелуі мүмкін.ақуыз желілері..
Тұтастай алғанда, біздің деректеріміз LSPT контекстіндегі төмендетілген желілердегі біртұтас валенттілік пен қанағаттандырылған/қанағаттанбаған өзара әрекеттесулердің өзектілігін қатты атап көрсетеді.Атап айтқанда, біз толық ұзындықтағы αS/Tau441 конденсаттары екі ақуызды қамтитын амилоид тәрізді гетероагрегаттарды қалыптастыру үшін тиімді біріктіріліп, ядролануға қабілетті екенін көрсетеміз және біздің эксперименттік нәтижелерге негізделген молекулалық механизмді ұсынады.Біз бұл жерде хабарлайтын αS/Tau сұйықтығы коацерватындағы екі ақуыздың бірлескен агрегациясы аурудың белгілері болып табылатын қосындылардағы екі ақуыздың бірге локализациясымен байланысты болуы мүмкін және LLPS және LLPS арасындағы қарым-қатынасты түсінуге ықпал етуі мүмкін. амилоидты агрегация, нейродегенерация кезінде жоғары зарядталған IDP жолын ашады.
Мономерлік WT-αS, цистеин мутанттары (Q24C-αS, N122C-αS) және ΔCt-αS нұсқалары (Δ101-140) E. coli-де экспрессияланды және бұрын сипатталғандай тазартылды.5 мМ DTT дисульфидті байланыстың түзілуін болдырмау үшін αS цистеин мутанттарын тазартудың барлық сатыларына қосылды.Tau441 изоформасы (№ 16316 нөмірі), δ1-150, δ1-150, δ1-150, IVA клондау арқылы алынған, CTTTAAGAAGGATCGATCGCGCCACCGCGC, catatgtatatcctctctttaagttaac) және aggdef-tau in inviant (δ275-311, тазартылған) GGCTC5 Primer) E. коли мәдениеттері болды 37°C және 180 айн/мин температурада OD600 = 0,6–0,7 дейін өсті және экспрессия 37°C температурада 3 сағат бойы IPTG көмегімен индукцияланды.Жасушаларды 11500 хг 4 °C температурада 15 минут бойы жинап, құрамында 150 мМ NaCl бар тұзды буфермен жуыңыз.Түйіршікті лизис буферінде қайта суспензиялаңыз (1 л LB үшін 20 мл: MES 20 мМ, рН 6,8, NaCl 500 мМ, EDTA 1 мМ, MgCl2 0,2 ​​мМ, DTT 5 мМ, PMSF 1 мМ, бензамидин 1 мкМ10п).Ультрадыбыспен өңдеу қадамы 10 импульс үшін 80% амплитудасы бар мұзда орындалды (1 мин қосулы, 1 мин өшіру).Бір ультрадыбыстық зерттеуде 60 мл-ден аспаңыз.E. coli лизаттары 20 минут бойы 95 ° C температурада қыздырылды, содан кейін мұзда салқындатылды және 40 минут бойы 127 000 × г центрифугалады.Тазаланған үстіңгі зат 3,5 кДа мембранаға (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Ұлыбритания) қолданылды және 4 л диализ буферіне (20 мМ MES, pH 6,8, NaCl 50 мМ, EDTA 1 мМ, MgCl2, DM 2 м) қарсы диализдендірілді. , PMSF 0,1 мМ) 10 сағат бойы.5 мл катион алмасу бағаны (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, АҚШ) тепе-теңдік буферімен (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PMSF, 0.1) теңестірілді.Тау лизат 0,22 мкм PVDF сүзгісі арқылы сүзіліп, 1 мл/мин ағын жылдамдығымен колоннаға енгізілді.Элюция біртіндеп жүргізілді, тау 15–30% элюционды буфермен (20 мМ MES, рН 6,8, 1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 2 мм DTT, 0,1 мМ PMSF) элюцияланды.Фракциялар SDS-PAGE арқылы талданды және болжанған молекулалық салмағы бар бір жолақты қамтитын кез келген фракциялар 10 кДа центрифуга сүзгісі арқылы концентрленді және 10 мМ HEPES, pH 7,4, NaCl 500 мМ және DTT 2 мМ бар буфермен ауыстырылды. ақуыздың соңғы концентрациясы 100 мкм болды.Содан кейін ақуыз ерітіндісі 0,22 мкм PVDF фильтрінен өтіп, тез мұздатылған және -80 ° C температурада сақталды.Протеин K18 профессор Альберто Боффидің қамқорлығымен қамтамасыз етілді.Препараттың тазалығы SDS-PAGE және MALDI-TOF/TOF растағандай >95% құрады.Әртүрлі цистеиндер химиялық түрде AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, АҚШ) немесе TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Торонто, Канада) белгісімен белгіленді.сіңіру және MALDI-TOF/TOF арқылы расталды.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau және K18 бірдей процедураны орындай отырып, Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Германия) көмегімен 191 және 322 позициялардағы табиғи цистеин қалдықтарымен белгіленді.αS және Tau441 үшін қалдық үшін таза төлем CIDER66 көмегімен жасалды.
Қатты поли-Л-лизин (pLK DP 90-110 жеткізушісінен NMR сәйкес, Alamanda Polymers Inc, Хантсвилл, Алабама, АҚШ) 10 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, рН 7,4 - 10 мМ концентрациясында ерітілді, процесс 5 ультрадыбыспен өңделді. минут ультрадыбыстық су ваннасында және -20 ° C температурада сақтаңыз.PEG-8, декстран-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, АҚШ) және FITC-dekstran-500 (Sigma -Oldrich, Sant Louis, MI, USA) суда ериді және LLPS буферінде кеңінен таралған.Диализ ластаушы тұздарды жояды.Содан кейін олар кеуек өлшемі 0,22 мкм шприц сүзгісі арқылы сүзілді және олардың концентрациясы рефрактометр көмегімен есептелді (Меттлер Толедо, Колумбус, Огайо, АҚШ).LLPS үлгілері бөлме температурасында келесі ретпен дайындалды: буфер мен экструзия араластырылды және 1 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 мМ 2,2,2,2-(этан- 1, 2-диилдинитрил) тетрасірке қышқылы (ЭДТА, карбоксинт) және 1% протеаза ингибиторының қоспасы (ПМСФ 100 мМ, бензимид 1 мМ, лейпептин 5 мкМ).Содан кейін αS және балқытылған поликатиондар (pLK немесе Tau опциялары) қосылады.Тиофлавин-T уақыт сериясы эксперименттері үшін (ThT, Carbosynth, Compton, UK) жалпы ThT концентрациясын αS концентрациясының жартысы болу үшін пайдаланыңыз.Үлгілердің біртекті болуын қамтамасыз ету үшін оларды ақырын, бірақ мұқият араластырыңыз.Әрбір компоненттің концентрациясы «Нәтижелер» бөлімінде сипатталғандай, тәжірибеден тәжірибеге дейін өзгерді.Тәжірибе ұзақтығы 4 сағаттан асқан сайын азид 0,02% (салм/көлем) концентрацияда қолданылды.LLPS үлгілерін қолданатын барлық талдаулар үшін қоспаны талдау алдында 5 минут бойы теңестіруге мүмкіндік беріңіз.Жарықтың шашырауын талдау үшін 150 мкл үлгілер байланыстырмайтын 96 шұңқырлы микропластинаға (µClear®, қара, F-Төменгі/Мұржа ұңғымасы, Greiner bio-one, Kremsmünster, Австрия) жүктеліп, жабысқақ пленкамен жабылған.ЖШС CLARIOstar пластинкасын оқу құрылғысында (BMG Labtech, Ортенберг, Германия) ерітіндінің ортасында 350 нм абсорбентті өлшеу арқылы бақыланды.Тәжірибелер 25°C температурада үш рет қайталанып, қателер орташа мәннен стандартты ауытқу ретінде есептелді.Сұйылтылған фаза үлгіні центрифугалау және SDS-PAGE гелін талдау арқылы сандық түрде анықталды, сұйылтылған және концентрленген фазалардағы αS фракциясы әртүрлі LLPS ерітінділерінде сандық түрде анықталды.Құрамында 1 мкм AF488 таңбаланған αS бар 100 мкл LLPS үлгісі мұқият араластыру арқылы дайындалды, содан кейін 30 минут бойы 9600×g центрифугалау жүргізілді, содан кейін тұнба әдетте көрінетін болды.Жоғарғы 50 мкл үстіңгі зат SDS-PAGE гелі арқылы ақуыз мөлшерін анықтау үшін пайдаланылды.Гельдер ChemiDoc гельді бейнелеу жүйесі (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, АҚШ) арқылы AF488 сүзгілерімен сканерленді немесе Coomassie бояуымен боялып, сәйкес сүзгілермен визуалды түрде көрсетілді.Алынған жолақтар ImageJ нұсқасының 1.53i (Ұлттық денсаулық институттары, АҚШ) көмегімен талданды.Тәжірибелер ұқсас нәтижелермен екі түрлі экспериментте екі данада жүргізілді.
Әдетте, 150 мкл үлгілер байланыстырмайтын 96 шұңқырлы микропластинаға қолданылды және бөлме температурасында Leica DMI6000B инверттелген микроскопта (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) визуалды.Нүктелік тәжірибелер үшін µ-Slide Angiogenesis пластиналары (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) немесе 96 шұңқырлы полистирол микропластиналары (Corning Costar Corp., Acton, Массачусетс) да пайдаланылды.Жарықтандыру көздері ретінде EL6000 галогендік немесе сынапты металл галогендік шамдар пайдаланылды (тиісінше BF/DIC және WF кескіні үшін).WF микроскопиясы үшін үлгідегі жарықты фокустау және оны жинау үшін 40 есе үлкейтетін ауа объектісі (Leica Microsystems, Германия) пайдаланылды.AF488 және ThT таңбаланған үлгілер үшін стандартты GFP сүзгі жиынтықтары, қоздыру және эмиссия жолағын өткізу сүзгілері, тиісінше, 460–500 нм және 512–542 нм өткізу жолағы сүзгілері және 495 нм дихрикалық айна бар сүзгі қозуы және эмиссиясы.Atto647N белгісімен белгіленген үлгілер үшін тиісінше 628–40 нм және 692–40 нм қозу және эмиссия жолағын өткізу сүзгілері бар Cy5 сүзгілерінің стандартты жинағы және 660 нм дихрикалық айна пайдаланылды.BF және DIC микроскопиясы үшін бірдей шағылысқан жарық жинау объектісін пайдаланыңыз.Жиналған жарық Leica DFC7000 CCD камерасында (Leica Microsystems, Германия) жазылған.Экспозиция уақыты BF және DIC микроскопиялық бейнелеу үшін 50 мс және WF микроскопиялық кескіндеу үшін 20-100 мс болды.Салыстыру үшін, ThT бар барлық эксперименттер үшін экспозиция уақыты 100 мс болды.Тамшылардың бірігуін визуализациялау үшін уақыт аралығымен эксперименттер орындалды, суреттер әр 100 мс сайын бірнеше минут бойы жиналады.Кескінді талдау үшін ImageJ (NIH, АҚШ) пайдаланылды.Тәжірибелер ұқсас нәтижелермен үш данада жүргізілді.
Коллокализация эксперименттері, FRAP және 3D реконструкциясы үшін кескіндер Zeiss LSM 880 инверттелген конфокальды микроскопта ZEN 2 көк басылымын (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германия) пайдалана отырып алынды.50 мкл үлгілер µ-Slide Angiogenesis Петри табақшаларына (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Германия) қолданылды, гидрофильді полимермен (ibiTreat) өңделді және 63 × майға батыру объектісіне орнатылды (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4) DIC бойынша).Суреттер 470–600 нм, 470–600–38 нм, қозу мен эмиссияны анықтау терезелері үшін 0,26 мкм/пиксель рұқсаты және 8 мкс/пиксель экспозиция уақыты бар 458 нм, 488 нм және 633 нм аргон лазерлік сызықтары арқылы алынды. және 638–755 нм сәйкесінше ThT, AF488 және Atto647N визуализациясы үшін пайдаланылды.FRAP эксперименттері үшін әрбір үлгінің уақытша фотосуреті секундына 1 кадрмен жазылды.Тәжірибелер ұқсас нәтижелермен бөлме температурасында үш дана орындалды.Барлық кескіндер Zen 2 көгілдір басылым бағдарламалық құралының көмегімен талданды (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германия).FRAP қисықтары қалыпқа келтірілді, сызылды және OriginPro 9.1 көмегімен Zen 2 көмегімен кескіндерден алынған қарқындылық/уақыт деректеріне сәйкестендірілді.Қалпына келтіру қисықтары молекулярлық диффузияны есепке алу үшін моно-экспоненциалды үлгіге орнатылып, ағарту әсерін есепке алу үшін қосымша экспоненциалды терминмен қосылды.Содан кейін біз D-ны номиналды ағарту радиусын және Канг және т.б. теңдеуіндегідей бұрын анықталған қалпына келтіру жартылай шығарылу кезеңін пайдаланып есептедік.5 35 көрсетілген.
αS жалғыз цистеиндік нұсқалары 24 (TEMPOL-24-αS) және 122 (TEMPOL-122-αS) позицияларында 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксилмен (TEMPOL) синтезделді, тиісінше.Айналдыру таңбалауы EPR тәжірибелері үшін αS концентрациясы 100 μM деңгейіне орнатылды және PEG концентрациясы 15% (салм/көлем) болды.Әртүрлі біріктіру жағдайлары үшін αS:pLK қатынасы 1:10 болды, ал αS:ΔNt-Tau және αS:Tau441 қатынасы 1:1 деңгейінде сақталды.Топтастыру болмаған кезде байланыстыру титрлеу эксперименттері үшін TEMPOL-122-αS 50 мкм деңгейінде сақталды және поликатиондар әрбір шартты бөлек дайындай отырып, жоғарылаған концентрацияларда титрленді.CW-EPR өлшемдері ~9,7 ГГц микротолқынды (SHF) жиілігінде жұмыс істейтін Bruker ER4118 SPT-N1 резонаторымен жабдықталған Bruker ELEXSYS E580 X диапазонының спектрометрі арқылы орындалды.Температура 25°C-қа орнатылды және сұйық азот криостатымен бақыланады.Спектрлер қанықпаған жағдайларда МВт қуаты 4 мВт, модуляция амплитудасы 0,1 мТ және модуляция жиілігі 100 кГц кезінде алынды.Үлгілер арасындағы спин концентрацияларындағы айырмашылықтарды және Tau441 немесе ΔNt-Tau (түпнұсқа ақуыз ерітінділерінде бар) бар үлгілердегі қалпына келтіретін агенттердің қалдық концентрацияларына байланысты ықтимал спиннің төмендеуін болдырмау үшін спектрлік қарқындылықтар қалыпқа келтірілді.Берілген g мәндері Matlab®67 жүйесінде енгізілген Easyspin бағдарламалық құралының (v. 6.0.0-dev.34) көмегімен орындалған EPR спектрлік модельдеу нәтижесінде алынды.Деректерді модельдеу үшін бір/екі компонентті изотропты модельдер қолданылды.Барлық сигналдарды қалыпқа келтіргеннен кейін қалдықтар сәйкес эксперименттік спектрден әрбір модельдеуді алып тастау арқылы есептелді.Байланыстыратын титрлеуді талдау үшін поликатиондардың αS-пен байланысуын бақылау үшін үшінші жолақтың нормаланған EPR спектрінің (IIII/III) екінші жолағына қатысты салыстырмалы қарқындылығы пайдаланылды.Диссоциация константасын (Kd) бағалау үшін алынған қисық n бірдей және тәуелсіз байланыстыру орындарын болжайтын шамамен үлгіге орнатылды.
ЯМР спектроскопиялық тәжірибелері криопробпен және Z-градиентімен жабдықталған Bruker Neo 800 МГц (1Н) ЯМР спектрометрін қолдану арқылы жүргізілді.Барлық эксперименттер 130–207 μM αS және 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 ішіндегі сәйкес αS/ΔNt-Tau және pLK эквиваленттері арқылы орындалды және 15°C температурада орындалды.LPS-ті ЯМР арқылы бақылау үшін алдын ала араластырылған үлгілерге 10% PEG қосылды.Химиялық ығысудың бұзылу графигі (1б-сурет) орташа 1Н және 15Н химиялық ығысуларды көрсетеді.αS 2D1H-15N HSQC спектрлері алдыңғы тағайындау негізінде тағайындалды (BMRB жазбасы №25227) және HNCA, HNCO және CBCAcoNH 3D спектрлерін жазу және талдау арқылы расталды.13Cα және 13Cβ химиялық ығысулар ΔNt-Tau немесе pLK қатысуымен таза кездейсоқ катушкалар конформациясындағы αS химиялық ығысуларымен салыстырғанда қайталама құрылым үрдістеріндегі ықтимал өзгерістерді өлшеу үшін есептелді 68 (қосымша 5c сурет).R1ρ жылдамдықтары 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 және 800 мс кешігулері бар hsqctretf3gpsi эксперименттерін (Брукер кітапханасынан алынған) жазу арқылы өлшенді және экспоненциалды функциялар әртүрлі қарқындылықтағы ең жоғары кешігуге реттелді. R1ρ және оның эксперименттік белгісіздігін анықтау үшін уақыт.
Уақыт бойынша ажыратылатын екі түсті флуоресценциялық микроскопиялық тәжірибелер уақыт бойынша корреляцияланған жалғыз фотонды санау (TCSPC) құрылғысы бар коммерциялық уақытты анықтайтын MT200 флуоресцентті конфокальды микроскопта (PicoQuant, Берлин, Германия) орындалды.Лазерлік диодтың басы импульстік аралық қозу (PIE) үшін пайдаланылады, сәуле бір режимді толқын өткізгіш арқылы өтеді және дихрикалық айнадан кейін өлшенген 481 нм және 637 нм лазер сызықтары үшін 10-нан 100 нВт-қа дейінгі лазер қуатына реттеледі.Бұл фотонды бүркеншіктеу, фотоағарту және қанықтыру әсерлерін болдырмай, фотонды санаудың оңтайлы жылдамдығын қамтамасыз етеді.μ-Слайд ангиогенезінің қабықшалары немесе пластиналары (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) түзететін жағасы бар Super Apochromat 60x NA 1.2 линзасының үстіне тікелей батыру суына орналастырылды (Olympus Life Sciences, Waltham, АҚШ).Негізгі сәулені бөлгіш ретінде 488/640 нм дихрикалық айна (Семрок, Лейк Форест, IL, АҚШ) пайдаланылды.Фокусталмаған сәулелену диаметрі 50 мкм тесік арқылы жабылады, содан кейін фокусталған сәулелену 50/50 сәуле бөлгіш арқылы 2 анықтау жолына бөлінеді.Детектордың алдында жасыл бояу үшін 520/35 (AF488) және қызыл бояу үшін 690/70 (Atto647N) жолақты эмиссия сүзгілері (Semrock, Lake Forest, IL, АҚШ) пайдаланылды.Детекторлар ретінде бір фотонды көшкін диодтары (SPAD) (Micro Photon Devices, Болзано, Италия) пайдаланылды.Деректерді жинау және талдау коммерциялық қол жетімді SymphoTime64 бағдарламалық құралын пайдалану арқылы орындалды (PicoQuant GmbH, Берлин, Германия).
μ-Slide ангиогенез ұңғымаларына (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) елу микролитр LLPS үлгілері қолданылды.Алынған кескіндер ілулі тамшылар үшін оңтайлы объективті жұмыс қашықтығы үшін ұңғыма түбінен 20 мкм жоғарыға және осьтік ажыратымдылығы кемінде 0,25 мкм/пиксель және кідіріс уақыты 400 мкм/пиксель болатын салдар мен нүктелер үшін ~1 мкм дейін фокусталады.Дисперсті фазадан кез келген ықтимал бастауды сүзіп, тек сұйық ақуыз тамшылары, салдар немесе дақтар таңдалатындай, әрбір арна үшін орташа фондық сигнал қарқындылығына (PBG, орташа + 2σ) негізделген қарқындылық шегін қолдану арқылы деректерді таңдаңыз.Әрбір арнаның әрбір түрінің (τ) өмір сүру ұзақтығын талдау үшін (жасыл, AF488 үшін «g» және қызыл, Atto647N үшін «r») біз тамшылар, салдар немесе дақтар бар қызығушылық аймақтарын (ROI) таңдадық (қосымша 1-сурет). ).8b) және олардың өмірлік ыдырауын (тамшылар, салдар немесе дақтар үшін τD, τR және τP, тиісінше, Қосымша 8c суретті қараңыз) әр арнаға тайға қонымды талдау және екі компонентті ыдырау үлгісін қолдану арқылы шығарды.τ бастап орташа τ .Көп экспоненциалды сәйкестік үшін тым аз фотон шығаратын ROI талдаудан шығарылды.Пайдаланылған кесу салдар мен нүктелер үшін <104 фотон және тамшылар үшін 103 фотон болды.Тамшылардың төменгі шегі бар, себебі жоғары қарқындылық мәндері бар ыдырау қисықтарын алу қиын, өйткені кескін өрісіндегі тамшылар әдетте кішірек және саны аз болады.Фотондар саны фотонды жинақтау шегінен жоғары (>500 санау/пикселге орнатылған) ROI да талдау үшін жойылды.Қызығушылық танытатын аймақтан алынған қарқындылықтың ыдырау қисығын барлық қарқындылық ыдырауы үшін бірдей сақтай отырып, минималды IRF кедергісін қамтамасыз ету үшін қызмет ету мерзімінің басынан бастап максимумның 90% қарқындылығымен (ыдыраудың максималды қарқындылығынан сәл кейін) сәйкестендіріңіз. параметрлер Салыстырмалы уақыт терезесі Салдар мен дақтар үшін 25-50 ROI және тамшылар үшін 15-25 ROI талданды, кем дегенде 3 тәуелсіз эксперименттен жазылған 4-тен астам қайталаудан таңдалған кескіндер.Түрлер арасындағы немесе коацерваттық жүйелер арасындағы статистикалық айырмашылықтарды бағалау үшін екі жақты t-тесттері қолданылды.Өмір сүру уақытын пиксель бойынша пиксель бойынша талдау үшін (τ) әрбір арна үшін өрістегі қызмет ету уақытының жалпы әлсіреуі есептелді және 2/3-компонентті экспоненциалды әлсіреу үлгісінің жуықтауы орындалды.Әр пиксельдің қызмет ету мерзімінің әлсіреуі бұрын есептелген τ мәндері арқылы орнатылды, нәтижесінде жалған түсті FLIM сәйкес кескін пайда болды.Бір арнаның барлық кескіндері бойынша тайға қонымды қызмет ету диапазоны бірдей болды және әрбір ыдырау сенімді сәйкестікті қамтамасыз ету үшін жеткілікті фотондарды шығарды.FRET талдауы үшін пикселдер 11 фотонның фондық сигналын (FBG) орташалаған 100 фотонның төменгі қарқындылық шегін қолдану арқылы таңдалды.Әрбір арнаның флуоресценция қарқындылығы эксперименталды түрде анықталған түзету факторларымен түзетілді: 69 спектрлік айқас α 0,004, тікелей қозу β 0,0305, анықтау тиімділігі γ 0,517.Пиксель деңгейіндегі FRET тиімділігі келесі теңдеу арқылы есептеледі:
мұндағы FDD – донорлық (жасыл) арнада байқалатын флуоресценция қарқындылығы, FDA – жанама қозу кезінде акцепторлық (қызыл) арнада байқалатын флуоресценция қарқындылығы, ал FAA – тікелей қозу кезінде акцепторлық (қызыл) арнада байқалатын флуоресценция қарқындылығы ( PIE).Арнада флуоресценция қарқындылығының импульстары байқалады).
LLPS буферіне (жоғарыда көрсетілгендей толықтырылған) құрамында 25 мкМ таңбаланбаған мономерлік Tau441 (25 мкМ αS бар немесе онсыз) бар LLPS реакциясының ерітінділерін 100 мкл желім фольга жабыны бар байланыстырмайтын 96 шұңқырлы микропластинаға салыңыз және тамшылардың түзілуі WF микроскопиясы арқылы тексерілгеннен кейін. тепе-теңдік.10 мин ішінде.Бөлме температурасында 48 сағат инкубациядан кейін ақуыз салдары мен дақтарының болуы расталды.Содан кейін ұңғымалардан салдардың үстінен сұйықтықты абайлап алып тастаңыз, содан кейін 50 л диссоциация буферін (10 мМ HEPES, рН 7,4, 1 М NaCl, 1 мМ DTT) қосыңыз және 10 минут бойы инкубациялаңыз.Тұздың жоғары концентрациясы қалдық PEG салдарынан LLPS қайталанбауын қамтамасыз етеді және тек электростатикалық өзара әрекеттесу нәтижесінде пайда болатын ықтимал ақуыз жинақтары бөлшектеледі.Содан кейін ұңғыманың түбі микропипетка ұшымен мұқият қырылып, алынған ерітінді бос бақылау ұңғымасына ауыстырылды.Үлгілерді 1 сағат бойы 50 мкм ThT инкубациялаудан кейін оқшауланған дақтардың болуы WF микроскопиясы арқылы тексерілді.700 мкл 70 мкМ αS ерітіндісін рН 7,4, натрий азиді 0,01% 37 °C және 200 айн/мин жылдамдықпен орбиталық шайқағышта 7 күн бойы инкубациялау арқылы ультрадыбыстық αS фибрилдерін дайындаңыз.Содан кейін ерітінді 9600 × г температурада 30 минут бойы центрифугаланды, түйіршік PBS рН 7,4 деңгейінде қайта суспензияланды және ультрадыбыстық (1 мин, 50% цикл, Vibra-Cell VC130 ультрадыбыстық аппаратында 80% амплитудасы, Sonics, Ньютон, АҚШ) фибрил үлгілері. шағын фибрилдердің салыстырмалы түрде біркелкі өлшемді таралуымен.
FCS/FCCS талдауы және екі түсті сәйкестікті анықтау (TCCD) PIE режимін пайдалана отырып, FLIM-FRET микроскопиялық эксперименттер үшін пайдаланылатын бірдей MT200 уақыт бойынша шешілген флуоресцентті конфокальды микроскопта (Pico-Quant, Берлин, Германия) орындалды.Бұл эксперименттер үшін лазер қуаты 6,0 мкВт (481 нм) және 6,2 мкВт (637 нм) қосылды.Осы лазерлік қуаттардың комбинациясы оңтайлы санау жылдамдығына қол жеткізу және фотоағарту мен қанықтыруды болдырмай, пайдаланылатын флюорофор жұптары үшін ұқсас жарықтықты алу үшін таңдалды.Деректерді жинау және талдау коммерциялық қол жетімді SymphoTime64 нұсқасы 2.3 бағдарламалық құралын пайдалану арқылы орындалды (PicoQuant, Берлин, Германия).
LLPS көмегімен алынған оқшауланған αS/Tau агрегаттарының үлгілері тиісті мономолекулалық концентрацияға дейін оқшаулау буферінде сұйылтылады (әдетте 1:500 сұйылту, өйткені агрегаттар коацерват үлгілерінен оқшауланған кезде төмен концентрацияда болады).Үлгілер 1 мг/мл концентрацияда BSA ерітіндісімен алдын ала қапталған жабындарға (Корнинг, АҚШ) тікелей қолданылды.
Жасыл және қызыл арналардағы PIE-smFRET талдауы үшін мономерлік оқиғалардан туындаған төмен қарқындылық сигналдарын сүзу үшін 25 фотонды төмен қарқындылық шегі қолданылды (мономерлер оқшауланған агрегаттармен салыстырғанда жинақталған үлгілерден көп екенін ескеріңіз).Бұл шек талдау үшін агрегаттарды арнайы таңдау мақсатында таза мономер үлгілерін талдау нәтижесінде алынған мономерлі αS орташа қарқындылығының бес еселенген мөлшері ретінде есептелді.PIE жетек тізбегі TSCPC деректерін жинақтаумен бірге фондық және спектрлік қиылысуды жоюға көмектесетін өмірлік салмақ сүзгісін қолдануға мүмкіндік берді.Жоғарыда көрсетілген шектерді пайдаланып таңдалған алау қарқындылығы тек буферлік үлгілердің қарқындылығына/байлануына қарсы пайда болу гистограммаларынан анықталған орташа фондық сигнал арқылы түзетілді.Үлкен агрегаттармен байланысты жарылыстар әдетте уақыт жолында (1 мс-ке орнатылған) бірнеше қатарынан қалталарды алады.Бұл жағдайларда максималды беріктігі бар қорап таңдалды.FRET және стехиометриялық талдау үшін теориялық тұрғыдан анықталған гамма-фактор γ (0,517) пайдаланылды.Спектрлік қиылысу және тікелей қоздыру үлестері қолданылған қоздыру лазерінің қуатында шамалы (тәжірибе арқылы анықталады).Жарылыс кезіндегі FRET тиімділігі мен стехиометриясы келесідей есептеледі.