ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Химия өнеркәсібіне арналған дуплексті дәнекерленген түтік, химиялық компонент, SPECC1L тапшылығы біріктірілген буындардың тұрақтылығының жоғарылауына және бассүйек жүйке жасушаларының төгілуінің төмендеуіне әкеледі.

Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Химия өнеркәсібіне арналған дуплексті дәнекерленген түтік

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.баспайтын болаттан жасалған жіксіз құбырлар, жарқын күйдірілген түтіктер, жіксіз ширатылған түтіктер және т.б. мамандандырылған жетекші өндіруші болып табылады.Тұтынушыларды жеңілдету үшін бізде дәнекерленген құбырлар мен құбырлар да бар.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ең озық өндіру және сынау жабдықтары бар.Біз сіздің сұранысыңызды толығымен қанағаттандыра аламыз.Стандартқа сәйкес, біз шығаратын түтіктер әрқашан дұрыс OD және WT төзімділігіне ие.Толеранттылықты бақылау стандарттарға қатаң сәйкес келеді.Біздің өнімдер әрқашан тұтынушылардың көңілінен шығады.Біздің өнімдерді сатып алушылар көбірек пайда әкелді.
a) OD (сыртқы диаметрі ): 3,18 мм - 101,6 мм
b) WT (Қабырға қалыңдығы ): 0,5 мм - 20 мм
c) Ұзындығы: тұтынушының талабына сәйкес
d) Стандарттар: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 және т
e) Процесс әдісі: ERW, EFW т.б

Әр слайдта үш мақаланы көрсететін слайдерлер.Слайдтар арқылы жылжу үшін артқа және келесі түймелерді немесе әр слайд бойынша жылжу үшін соңында слайд контроллері түймелерін пайдаланыңыз.
Бас сүйегінің жүйке қыртысының жасушалары (CNCC) эмбриональды жүйке қатпарларын жұлып тастап, ортаңғы бет құрылымдарының көпшілігін құрайтын фарингальды доғаларға ауысады.CNCC дисфункциясы ауыз-бет жырығының этиологиясында маңызды рөл атқарады, кең таралған туа біткен ақау.Гетерозиготалы SPECC1L мутациялары атипті және синдромдық жырықтары бар емделушілерде табылған.Мұнда біз канондық жабысқақ қосылыс (AJ) компоненттерінің, β-катенин мен Е-кадериннің өсірілген SPECC1L нокдаундық жасушаларында жақсартылған бояуы туралы хабарлаймыз және электронды микросуреттер AJ апикальды-базальды диффузиясын көрсетеді.SPECC1L краниофациалды морфогенездегі рөлін түсіну үшін біз Specc1l тапшылығы бар тінтуір үлгісін жасадық.Гомозиготалы мутанттар эмбриональды өлімге әкеледі және жүйке түтігінің жабылуы мен CNCC ламинациясының бұзылуын көрсетеді.Мутантты жүйке қатпарларында AJ протеинінің бояуы жоғарылайды.Бұл AJ ақауы AJ ерітуін қажет ететін CNCC деламиминациясындағы ақауға сәйкес келеді.Сонымен қатар, Specc11 мутанттары PI3K-AKT сигналын азайтып, апоптозды күшейтті.In vitro жабайы типтегі жасушаларда PI3K-AKT сигнализациясының жеңіл тежелуі AJ өзгерістерін индукциялау үшін жеткілікті болды.Маңыздысы, SPECC1L нокдаунынан туындаған AJ өзгерістерін PI3K-AKT жолын белсендіру арқылы қалпына келтіруге болады.Біріктірілген бұл деректер SPECC1L PI3K-AKT сигнализациясының және AJ биологиясының жаңа реттеушісі ретінде жүйке түтігін жабу және CNCC стратификациясы үшін қажет екенін көрсетеді.
Бас миының жүйке қыртысының жасушалары (КНК) дорсальды нейроэктодермаға локализацияланады және эпителий-мезенхималық ауысуды (ЭМТ) қамтитын процесс арқылы дамып келе жатқан жүйке қатпарларының нейроэпителийінен ажырайды1,2,3.Премиграциялық эпителиальды CNCC-тер жасушааралық түйіспелерді бұзады және бірінші және екінші жұтқыншақ доғаларын толтыратын және бассүйек-бет шеміршектің көп бөлігін құрайтын миграциялық мезенхималық CNCC-ге айналады.Осылайша, CNCC функциясын реттейтін гендер көбінесе тек АҚШ-та туылғандардың 1/800-іне әсер ететін, ауыз-бет саңылаулары сияқты краниофациалды туа біткен аномалиялардың этиологиясында жиі бұзылады.Туа біткен деформациялардың бірі8.
CNCC деламинациясы тышқандардағы эмбриональды дамудың 8,5 және 9,5 күндері арасындағы алдыңғы жүйке түтігінің жабылуымен сәйкес келеді.Тінтуірдің ауыз-бет жырығымен байланысты гендердің бірқатар мутанттары жүйке түтігі ақауының кейбір түрін көрсетеді, соның ішінде Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 және Pdgfrα12.Дегенмен, жүйке түтігін жабу және CNCC стратификация процестерін тәуелсіз деп санауға болады, өйткені Splotch мутант тінтуірі (Pax3) CNCC стратификациясына немесе миграциясына ешқандай әсер етпестен жүйке түтігінің жабылуында ақауларды көрсетеді 13,14.CNCC диссекциясында және жүйке түтігін жабуда ақаулары бар қосымша тінтуір үлгілері осы екі процестің ортақ молекулалық негізін анықтауға көмектеседі.
Нейроэпителиальды жасушалардан CNCC оқшаулануы басқалармен қатар актин жіптерімен байланысты E-кадерин, β-катин, α-Е-катин және α-актинин бар ақуыздық кешендерден тұратын адгезиялық түйіспелерді (AJs) ерітуді қажет етеді 2 Нейрондық қатпарлардағы E-кадериннің шамадан тыс экспрессиялық зерттеулері CNCC деламиминациясының төмендеуін немесе кешігуін көрсетті.Керісінше, E-кадериннің басылуы ерте стратификацияға әкеледі15,16.CNCC стратификациясы кезінде EMT-ге делдал болатын факторлардың көпшілігі транскрипция факторлары (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) және матрицалық металлопротеиназалар (MMPs) сияқты жасушадан тыс матрицаны (ECM) қалпына келтіретін ақуыздар болып табылады, бірақ CNCCs тікелей цитоскелеттік AJ болып табылады. әлі белгісіз.PI3K-AKT жолы негізінен онкологиялық зерттеулерден алынған E-кадерин деңгейіне қарсы әсер ететіні белгілі.Жақында жүргізілген зерттеулер тышқандарда PDGFα негізіндегі PI3K-AKT сигналының жоғалуы бас сүйек-бет аномалияларына, соның ішінде таңдайдың жырығы мен жүйке түтігі ақауларына әкелетінін көрсетті12.Дегенмен, PI3K-AKT жолы мен CNCC стратификациясындағы AJ тұрақтылығы арасындағы байланыс анық емес.
Біз бұған дейін SPECC1L-ті ауыздан көзге дейін созылатын, қиғаш саңылау (ObFC) немесе Tessier IV18 жырығы деп аталатын ауыр жырығы бар екі адамдағы бірінші мутант гені ретінде анықтадық.SPECC1L мутациялары аутосомды-доминантты Opitz G/BBB синдромы (OMIM №145410) бар екі көп ұрпақты отбасында анықталды, оларда зардап шеккен адамдарда гипердистанция және ерін/таңдай жырықтары19 және Тиби шамадан тыс қашықтық синдромы бар бір отбасында (OMIM №145420)20 анықталды. .Opitz G/BBB синдромы жағдайларының жартысынан көбі X-байланыстырылған (OMIM #300000) және микротүтікшелермен байланысқан жасуша қаңқасының 22-белокын кодтайтын MID1 генінің мутацияларынан туындайды.Біз SPECC1L, сонымен қатар микротүтікшелермен және актин цитоскелетімен байланысты ақуыз, жасуша адгезиясы мен миграциясы 18 кезінде актин цитоскелеті қайта құру үшін қажетті сигнализацияға делдал болуы мүмкін деп болжаймыз.In vitro және in vivo зерттеулері арқылы біз енді SPECC1L-ді PI3K-AKT сигнализациясы арқылы AJ тұрақтылығының жаңа реттеушісі ретінде сипаттаймыз.Жасуша деңгейінде SPECC1L тапшылығы pan-AKT протеинінің деңгейінің төмендеуіне және AJ апикальды-базальды дисперсиясының жоғарылауына әкелді, ол AKT жолының химиялық активтенуі арқылы жойылды.In vivo, Specc11 жетіспейтін эмбриондар жүйке түтігінің жабылуының бұзылғанын және CNCC диссекциясының төмендеуін көрсетеді.Осылайша, SPECC1L бет морфогенезі кезінде қалыпты CNCC функциясы үшін қажет жоғары реттелген жасуша адгезиясына негізделген сигналда жұмыс істейді.
SPECC1L рөлін жасушалық деңгейде сипаттау үшін біз SPECC1L18 жетіспейтін бұрын сипатталған тұрақты остеосаркома U2OS жасуша желісін қолдандық.SPECC1L (kd) нокдауы бар бұл тұрақты U2OS жасушаларында SPECC1L транскрипттері мен ақуыздарының деңгейі орташа (60–70%) төмендеді, сонымен қатар актин цитоскелетінің көші-қоны мен қайта құрылуының ақаулары болды 18. Керісінше, айтарлықтай уақытша төмендеуі SPECC1L митоздық ақауларға әкеледі 23 .Әрі қарай сипаттаудан кейін біз тұрақты SPECC1L-kd жасушаларының қосылудың өте жоғары дәрежесінде морфологиясын өзгерткенін анықтадық (1-сурет).Жеке бақылау жасушалары мен төменгі түйісудегі kd жасушалары ұқсас болды (1A,D-сурет).Біріктірілгеннен кейін 24 сағаттан кейін бақылау жасушалары куб тәрізді пішінін сақтап қалды (сурет 1В, Е), ал SPECC1L-kd жасушалары ұзарды (1С, F-сурет).Жасуша пішінінің бұл өзгерісінің дәрежесі бақылау жасушалары мен kd жасушаларының in vivo тірі кескіні арқылы түсірілді (1-фильм).Қосылатын жасушалардағы SPECC1L рөлін анықтау үшін біз алдымен оның экспрессиясын зерттедік.Біз SPECC1L протеинінің деңгейлері біріктірілген кезде жоғарылағанын анықтадық (1G-сурет), ал SPECC1L транскрипт деңгейлері жоғарыламады (1Н-сурет).Сонымен қатар, жасуша тығыздығы артқан сайын, SPECC1L протеині жасушааралық шекараларда (2A-E суреті) жиналды, бұл үлгі мембранамен байланысты β-катениндікімен қабаттасады (2A'-E' сурет).SPECC1L актин цитоскелетімен 18,23 байланысын ескере отырып, біз SPECC1L актин негізіндегі адгезиялық қосылыстармен (AJ) әрекеттеседі деп болжадық.
(AF) SPECC1L нокдаун (DF) жасушалары бақылау U2OS жасушаларымен (AC) салыстырғанда жоғары қосылуда (F) ұзарады.Мұнда біз әртүрлі жасуша тығыздығы үшін таңдаған алты уақыт нүктесінің үшеуі (T1, T3, T6) көрсетілген.(G) SPECC1L протеині бақылау жасушаларындағы қосылудың төмен дәрежесімен салыстырғанда жоғары қосылу дәрежесінде тұрақтанғанын көрсететін Western blot талдауы.SPECC1L-дің батыс дақтары күтілетін 120 кДа диапазонын және жоғарырақ молекулалық салмақ жолағын көрсетеді, мүмкін трансляциядан кейін өзгертілген (*).Western blot талдауы төмен және жоғары қосылу үшін бірдей шарттарда орындалды.Төмен және жоғары қосылу кезінде SPECC1L көрсететін кескіндер бір нүктеден алынды.Дәл сол дақ жойылып, β-актин антиденесімен қайта зерттелді.(H) Сандық RT-ПТР талдауы SPECC1L транскрипт деңгейлерінде айтарлықтай өзгерістерді көрсетпеді.Қате жолақтары төрт тәуелсіз эксперименттің SEM-ін көрсетеді.
(AE) Біз SPECC1L нокдаунымен (kd) U2OS ұяшықтарындағы жасуша пішінінің талдауын және AJ өзгерістерін қалыпқа келтіру үшін жасуша тығыздықтарының ауқымын білдіретін алты уақыт нүктесін (T1-T6) таңдадық.Осы уақыт нүктелерінің алғашқы бесеуі бір ұяшықтарды (T1), шағын жасуша кластерлерінің 50-70% бірігуін (T2), kd жасушаларының пішінін өзгертпей біріктіруді (T3), kd жасушаларының пішінін өзгертуді (T4) және 24 сағаттық өзгерістерді қамтиды.kd (T5) жасушаларының артқы түрінде.SPECC1L протеині T1 (A) кезінде цитоплазмада негізінен дисперсті болды, бірақ оның жинақталуы жасушааралық шекараларда кейінгі уақыт нүктелерінде байқалды (B–E, көрсеткілер).(FJ) β-катенин AJ кешенімен байланысты жасушааралық шекараларда ұқсас жинақтауды көрсетеді.(A'-E') SPECC1L және β-катенин жоғары жасуша тығыздығында (көрсеткілер) жасуша шекараларында қабаттасатын бояуды көрсетеді.(F'-J') SPECC1L-kd жасушаларында β-катениннің бояуы төмен жасуша тығыздығында (F'-H') қалыпты болып көрінеді, бірақ жасуша пішіні өзгерген сайын кеңейеді (I', J'; көрсеткілер), бұл AJ екенін көрсетеді өзгерді.Жолақтар = 10 мкм.
Содан кейін біз SPECC1L тапшылығының AJ-ге әсерін анықтауға тырыстық.Біз F-актин, миозин IIb, β-катенин және Е-кадхерин24,25,26,27 канондық құрамдастарды қоса алғанда, бірнеше AJ байланысты маркерлерді қолдандық.Актин кернеуі талшықтары SPECC1L-kd жасушаларында жоғарыда сипатталғандай өсті (сурет 3A,B) 18 .Актин жіптерімен байланысты миозин IIb in vitro SPECC1L-kd жасушаларының ұқсас ұлғаюын көрсетті (3C,D-сурет).AJ-ассоциацияланған β-катенин жасуша мембранасындағы кадеринмен байланысады, бақылау кубоциттерінде қалыпты «бал ұясы» экспрессия үлгісін көрсетеді (3E,G-сурет).Бір қызығы, конфокальды микроскопияны пайдаланатын жалпақ кескіндерде β-катенин (3E,F-сурет) және E-кадерин (3G,H-сурет) біріктірілген SPECC1L жетіспейтін жасушалардың жасушалық мембранасында бояу ұзартылған бояудың көрнекті үлгілерін көрсетті.Kd жасушаларында AJ-ассоциацияланған β-катенин бояуының бұл кеңеюі қосылу кезінде ең айқын болды, бірақ жасуша пішінінің өзгеруінен бұрын көрінді (2F-J, F'-J' сурет).Бұл кеңейтілген AJ бояуының физикалық табиғатын анықтау үшін біз SPECC1L-kd U2OS жасушаларының апикальды-базальды бетіндегі жасуша шекараларын трансмиссиялық электронды микроскопия (TEM) арқылы зерттедік (3I,J сурет).AJ индикаторы (көрсеткілер) бөлек электронды тығыз аймақтары бар бақылау жасушаларынан (3I-сурет) айырмашылығы, kd жасушалары (3J-сурет) апикобазальды жазықтықта AJ индикаторы жоғары электрон тығыздығының үлкен, іргелес аймақтарын көрсетті..Сонымен қатар, көлденең кесінділерде біз kd жасушаларында кең жасуша мембранасының қатпарларын байқадық (сурет S1A, B), бұл β-катенин және Е-кадхерин бояу жолақтарының ұзартылған үлгісін түсіндіреді (3F, H сурет).AJs-де SPECC1L рөлін қолдау үшін β-катенин қосылатын U2OS жасушаларының лизаттарында SPECC1L-мен бірге иммунопреципитацияланды (3K-сурет).AJ маркерлері үшін кеңейтілген иммундық бояумен қатар, TEM талдауы SPECC1L тапшылығы AJ апикальды-базальды тығыздығы мен дисперсиясын арттырады деген гипотезамызға сәйкес келді.
(AH) Біріктіруден кейінгі 48 сағатта kd жасушаларында F-актинді бояудың жоғарылауы (T6; A, B).F-актинмен байланысты миозин IIb өзгерген бояуы (C, D).SPECC1L-kd (F, H) жасушаларында бақылау жасушаларында (E, G) β-катенин мен Е-кадхеринді мембрана бояуының тегіс үлгісі жақсарды.Жолақтар = 10 мкм.(I–J) Апикальды-базальды жасушааралық қосылыстарды бақылайтын электронды микросуреттер.Басқару ұяшықтары жабысқақ түйіспелерді (I, көрсеткілер) көрсететін айқын электронды тығыз аймақтарды көрсетеді.Керісінше, SPECC1L-kd жасушаларындағы барлық апикальды-базальды қосылыс электронды тығыз (J, көрсеткілер) болып көрінді, бұл тығыздықтың жоғарылауы мен адгезиялық қосылыстардың дисперсиясын көрсетеді.(K) β-катенин біріктірілген U2OS жасуша лизаттарында SPECC1L-мен бірге иммунопреципитацияланды.Төрт тәуелсіз эксперименттің бірін көрсететін бір нүктеден алынған сурет.
SPECC1L-нің бассүйек-беттік морфогенездегі рөлін түсіну үшін біз интрон 1 және Specc1l транскрипттері түсірілген DTM096 және RRH048 (BayGenomics, CA) екі тәуелсіз ES тұзақ ұяшық сызығын пайдаланып Specc1l тапшылығы бар тінтуір үлгісін жасадық (сурет 115) .4A, S2 суреті).Декоя векторының кірістіруінің геномдық орны тұтас геномды секвенирлеу арқылы анықталды және ПТР арқылы расталды (S2-сурет).Ген тұзақтарының екеуі де түсірілген кезде Specc11-lacZ репортерлерінің кадр ішіндегі біріктірілуіне мүмкіндік берді.Сондықтан X-gal бояуымен анықталған lacZ өрнегі Specc11 өрнегі индикаторы ретінде пайдаланылды.Екі аллель де ұқсас lacZ экспрессия үлгілерін көрсетті, 1-интрондағы DTM096 гендік тұзағы 15-интрондағы RRH048-ге қарағанда күштірек экспрессияны көрсетеді (көрсетілмеген).Дегенмен, Specc1l кеңінен көрінеді, әсіресе E8.5-тегі жүйке қатпарларында (4В-сурет), жүйке түтігі мен E9.5 және E10.5-тегі бет процестерінде (4C,D-сурет) және дамып келе жатқан аяқ-қолдарда ерекше күшті көрініс береді. E10 кезінде.5 және көздер (4D-сурет).Біз E10.5 нүктесіндегі бірінші жұтқыншақ доғасындағы SPECC1L экспрессиясы эпителийде және негізгі мезенхимада18, CNCC желісімен сәйкес келетінін бұрын хабарлаған болатынбыз.CNCC жүйесінде SPECC1L экспрессиясын тексеру үшін біз E8.5 нейрондық қатпарларды (4E-J-сурет) және E9.5 бас сүйегінің бөлімдерін (4K- суреті) орындадық.E8.5-те SPECC1L нейрондық қатпарларды қарқынды түрде бояды (4E, H-сурет), соның ішінде NCC маркерлерімен боялған жасушалар (4G, J-сурет).E9.5-те, SPECC1L (4K, N-сурет) AP2A (4L, M-сурет) немесе SOX10 (сурет 4O, P) бірге боялған миграциялық CNCC қатты боялған.
(A) ES DTM096 (интрон 1) және RRH048 (интрон 15) жасуша клондарында алдау векторын енгізуді көрсететін тінтуірдің Specc11 генінің схемалық көрінісі.(BD) E8.5 пен E10.5 аралығындағы Specc1l экспрессиясын білдіретін гетерозиготалы Specc1lDTM096 эмбриондарының lacZ бояуы.NE = нейроэктодерма, NF = жүйке қатпары, PA1 = бірінші жұтқыншақ доғасы.(EP) E8.5 (NF; EJ) нейрондық қатпарлардағы және E9.5 (KP) бас сүйек бөліктеріндегі NCC маркерлерімен AP2A және SOX10 SPECC1L иммунобояуы.SPECC1L бояуы AP2A (F, G; көрсеткі ұштары) және SOX10 (I, J; көрсеткі ұштары) таңбаланған ұяшықтарды қоса, E8.5 (E, H; көрсеткі ұштары) жүйке қатпарларында кеңінен байқалды.E9.5 кезінде SPECC1L қатты боялған көшірілетін CNCC (K, N; көрсеткілер) таңбаланған AP2A (L, M; көрсеткілер) және SOX10 (O, P; көрсеткілер).
Гетерозиготалы Specc1lDTM096/+ және Specc1lRRH048/+ тышқандары арасындағы қиылысу екі ген тұзағы аллельдері комплементарлы емес екенін және ген тұзағы аллельінің кез келгеніне арналған қосынды гетерозиготалар мен эмбриондық гомозиготалардың эмбрионалды өлімге әкелетінін көрсетеді (S1 кесте).Мендельдік коэффициенттер туған кездегі гетерозиготалардың өмір сүру деңгейінің төмендеуін көрсетті (күтілетін 1,34 қарсы 2,0).Біз гетерозиготалардың арасында перинаталдық өлімнің төмендігін атап өттік, кейбіреулерінде бас сүйек-бет аномалиялары болды (S3-сурет).Дегенмен, осы перинаталды краниофациалды фенотиптердің төмен енуі олардың негізгі патофизиологиялық механизмдерін зерттеуді қиындатады.Сондықтан біз гомозиготалы Specc11 мутанттарының эмбриональды өлімге әкелетін фенотипіне назар аудардық.
Көптеген күрделі гетерозиготалы немесе гомозиготалы Specc1lDTM096/RRH048 мутантты эмбриондар E9.5–10.5 (5A–D-суреттер) кейін дамымаған және жүйке түтігі алдыңғы жағынан жабылмаған (сурет 5B, D) және кейде артқы жағынан жабылған (көрсетілмеген) ..Бұл бассүйек жүйке түтігінің жабылу ақауы E10.5-те нейрондық қатпарларда қалған DLX2 белгіленген CNCC көпшілігімен байланысты болды, бұл диссекцияның жоқтығын көрсетеді (5A'-D' сурет).CNCC жалпы өлшемі де азайғанын анықтау үшін біз Wnt1-Cre және ROSAmTmG бар гендік тұзақ сызықтарымызда GFP бар CNCC сызықтарын белгіледік.Біз тұтас эмбриондардан сұрыпталған GFP+ NCC және GFP- (RFP+) емес NCC ағынын ағынмен ағынмен жібереміз.E9.5 деңгейінде ағынмен сұрыпталған GFP таңбаланған CNCC үлесі WT және мутантты эмбриондар (көрсетілмеген) арасында айтарлықтай өзгермеді, бұл қалыпты CNCC спецификациясын көрсетеді.Сондықтан, біз ашық нейрондық қатпарлардағы қалдық Wnt1-Cre және DLX2 бояуы (5В' сурет) ақаулы CNCC қабаттасуымен, мүмкін, SPECC1L-kd жасушаларында көрінетін AJ жасушаларының тығыздығы немесе дисперсиясының жоғарылауымен байланысты деп болжадық.Біз нейрондық қатпарда CNCC бар екенін растау үшін SOX10, AP2A және DLX2 NCC маркерлерін қолдандық (5E-R сурет).E8.5-те WT (5E, G, I-сурет) және Specc1l мутантының (5F, H, J-сурет) бөлімдерінде барлық үш NCC маркерлері үшін нейрондық қатпарлы бояу байқалды.E9.5-те NCC маркерлері WT бөлімдеріндегі көшіп-қонатын NCC-ны бояған кезде (5M, O, Q-сурет), Specc1l мутант эмбриондарының ашық нейрондық қатпарларында қалдық NCC бояуы байқалды (5N, P, R сурет).SOX10 және DLX2 көшірілетін CNCC-терді белгілейтіндіктен, бұл нәтиже SPECC1L жетіспейтін CNCC-тер миграциядан кейінгі спецификацияға қол жеткізеді, бірақ нейрондық қатпарлардан көшпейді.
Specc11 тапшылығы нерв түтігінің ақаулы жабылуына, бас сүйек-ми нерв қыртысының жасушалары мен АЖ-нің деламинациясына әкеледі.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') белгісімен таңбаланған миграциялық бассүйек нерв қыртысының жасушаларын (CNCC) тасымалдайтын эмбрион.Керісінше, Specc11 мутантты эмбриондары ашық нейрондық қатпарларды (B), көрсеткі ұштары) және ауыспаған CNCCs (B', көрсеткі ұштары) көрсетеді.(C, D') E10.5 WT эмбриондарының (C, C') және Specc1l (D, D') CNCC DLX2 маркерінің ашық өріс кескіндері (C, D') және иммундық бояуы (C', D').WT E10.5 эмбриондарында DLX2-оң CNCC желбезек доғаларын (С', көрсеткілер) колонизациялайды, ал мутанттарда ашық жүйке қатпарларында (D', көрсеткілер) және бірінші жұтқыншақ доғаларында (D',) айқын бояу сақталады. көрсеткілер).) кейбір бояулармен (көрсеткілер) нашар қабаттасуды және CNCC миграциясын көрсетеді.ER) WT және Specc1l мутант эмбриондарының E8.5 (E–L) және E9.5 (M–R) кезеңдеріндегі бөлімдері SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) және DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 деңгейінде NCC бояуы жабайы типтегі нейрондық қатпарларда (NF) және мутантты бөлімдерде байқалды.SOX10 және β-катенинді E8.5 WT (K) және мутант (L) бірлесе бояу нейрондық қатпарлардағы жасуша шекараларында β-катениннің жоғарылауын анықтады.E9.5-те көшіп-қонатын CNCC-тердің (M, O, Q) жабайы түрдегі бояуы байқалды, ал мутанттарда стратификацияланбаған CNCC-тер ашық нейрондық қатпарларды (N, P, R) бояды.(S–Z) E9.5 мутациясы бар WT және Specc11DTM096/RRH048 эмбриондарының тәждік бөлімдеріндегі In vivo AJ таңбалау талдауы.Жоғарғы оң жақ бұрышта шамамен секциялық жазықтық көрсетілген.Мутантты тіндердің бөлімдерінде F-актиннің (S, T) және миозин IIb (U, V) боялуының жоғарылауы байқалды.3-суреттегі in vitro нәтижелеріне ұқсас мутантты эмбриондарда β-катенин (W, X) және E-кадхерин (Y, Z) үшін күшейтілген мембраналық бояу байқалды.(AA-BB) Жабайы типтегі эмбрионның апикальды-базальды жасушаның шекарасынан тыс бөлігінің электрондық микрографиясы жабысқақ қосылыстарды көрсететін айқын электронды тығыз аймақты көрсетеді (AA, көрсеткілер).Керісінше, Specc11 мутантты эмбриондарының бөлімдерінде (BB, көрсеткілер) бүкіл апикобазальды қосылыс электронды тығыз болып табылады, бұл тығыздықтың жоғарылауы мен адгезиялық қосылыстардың дисперсиясын көрсетеді.
Қабаттардың азаюы өзгерген AJ салдарынан болады деген гипотезаны тексеру үшін біз Specc1l мутант эмбриондарының ашық нейрондық қатпарларындағы AJ таңбалауын зерттедік (5S-Z-сурет).Біз актиндік кернеу талшықтарының ұлғаюын (5S, Т-сурет) және актин талшықтарында миозин IIB бояуының бір мезгілде локализациясының жоғарылауын байқадық (сурет 5U, V).Маңыздысы, біз жасушааралық шекараларда β-катениннің (5W,X-сурет) және Е-кадхериннің (5Y,Z-сурет) боялуының жоғарылауын байқадық.Біз сондай-ақ E8.5 эмбриондарының нейрондық қатпарларындағы NCC-нің β-катенинді бояуын зерттедік (сурет 5K, L).Specc1l мутантты нейрондық қатпарларда β-катенинді бояу күштірек болып көрінді (сурет 5L және K), бұл AJ өзгерістерінің басталғанын көрсетеді.E9.5 эмбриондарының бас сүйек бөліктерінің электронды микросуреттерінде біз WT-мен салыстырғанда Specc1l мутант эмбриондарында диффузды электронды-тығыз бояудың жоғарылауын тағы да байқадық (5AA, BB және S1E-H сурет).Біріктірілген бұл нәтижелер SPECC1L-kd U2OS жасушаларында біздің in vitro нәтижелерімізді қолдайды және аберрантты AJ бояуы мутантты эмбриондардағы CNCC стратификациясынан бұрын болатынын болжайды.
AKT белсенділігі мен E-cadherin тұрақтылығы арасындағы белгілі антагонистік байланысты ескере отырып, 17,28 біз PI3K-AKT сигнализациясының қатысуын болжадық.Сонымен қатар, біз кейбір мутант эмбриондарымызда E9.5-10.5 деңгейінде өлімнен құтылған (<5%) және оның орнына E13.5 шамасында орналасатын субэпидермальды көпіршіктерді байқадық (S3-сурет).Субепидермальды везикулалар PDGFRα12 негізіндегі PI3K-AKT сигналының төмендеуінің белгісі болып табылады.Fantauzzo және т.б.(2014) PdgfraPI3K/PI3K мутантты эмбриондарындағы PDGFRα негізіндегі PI3K активациясының бұзылуы субэпидермальды көпіршіктерге, жүйке түтігінің ақауларына және таңдайдың жырық фенотиптеріне әкелетінін хабарлады.Шынында да, pan-AKT және белсенді фосфорланған Ser473-AKT деңгейлері Specc1l мутантты тіндерінде in vivo E9.5 эмбриональды ұстамаға дейін төмендеді (6A-D сурет).Фосфорланған Ser473-AKT деңгейлерінің төмендеуі толығымен in vivo (6E-сурет) және in vitro (6F-сурет) pan-AKT деңгейлерінің төмендеуіне байланысты болуы мүмкін.In vitro төмендеуі U2OS жасушалары жасуша пішіні мен AJ тығыздығының өзгеруімен қатты үйлескенде ғана байқалды (6D-сурет).Осылайша, біздің деректер SPECC1L краниофациалды морфогенездегі PI3K-AKT сигнализациясының жаңа оң реттеушісі екенін көрсетеді.
(A–E) E8.5 (A,B) және E9.5 (C,D) бас сүйек бөліктері немесе Specc1l мутант эмбриондарының (E) E9.5 лизаттары белсенді фосфорланған S473-AKT және pan-AKT протеинді азайту деңгейлерін көрсетеді , WT бақылауымен салыстырғанда.Вестерн-блотинг жабайы типтегі лизаттарда және мутантты лизаттарда бірдей жағдайларда орындалды.SPECC1L үшін көрсетілген кескіндер бір нүктеден алынды.Дәл сол дақ жойылып, анти-пан-АСТ және β-актин антиденелерімен қайта зерттелді.E8.5 нейрондық қатпарлардағы (A, B) пан-АКТ деңгейлері және E9.5 бас сүйек бөліктеріндегі фосфорланған S473-AKT деңгейлері айтарлықтай төмендеді.(F) Pan-AKT деңгейлері жоғары қосылу кезінде жиналған SPECC1L-kd U2OS жасушаларының лизаттарында бірдей төмендеді.Қате жолақтары үш тәуелсіз Western Blot санынан алынған SEM-ді білдіреді.(GJ) WT эмбриондарының E9.5 бөлімдері KI67-мен боялған және тиісінше 3-каспазамен боялған, жасуша пролиферациясын (G, G') және аз апоптоздық белсенділікті (H, H') көрсетеді.Specc11 мутант эмбриондары салыстырмалы жасуша пролиферациясын (I) көрсетеді, бірақ апоптоздан өтетін жасушалардың саны айтарлықтай артады (J).
Содан кейін біз пролиферация және апоптоз маркерлерін зерттедік.Біз KI67 бояуымен өлшенген WT мутанттары үшін 82,5% және Specc1l мутанттары үшін 86,5% пролиферация индексі бар E9.5 эмбриондарының (I-мен салыстырғанда 6E, G суреті) пролиферациясында ешқандай айырмашылықты байқамадық (p <0,56, Фишердің көрсеткіші). нақты сынақ).Сол сияқты, біз эмбрионды қамауға алғанға дейін (көрсетілмеген) (көрсетілмеген) E8.5 деңгейінде нейрондық қатпарлардағы бөлінген каспазаны 3 бояу арқылы өлшенген апоптозда ешқандай айырмашылықты байқамадық.Керісінше, апоптоз барлық E9.5 мутантты эмбриондарда айтарлықтай артты (сурет 6F, H және J).Апоптоздың бұл жалпы өсуі PI3K-AKT сигналының төмендеуіне және ерте эмбриональды өлімге сәйкес келеді29,30,31.
Әрі қарай, біздің kd жасушаларындағы AJ өзгерістеріндегі PI3K-AKT сигналының себептік рөлін растау үшін біз бақылау және kd жасушаларындағы жолды химиялық түрде өзгерттік (7A-F-сурет).Маркер ретінде біз біріктірілген SPECC1L-kd жасушаларында байқалған жасуша пішінінің өзгеруі фенотипін қолдандық, біз оны ең ұзын өлшемнің (ұзындық) сәйкес тік өлшемге (ені) қатынасын пайдалана отырып, сандық түрде анықтадық.Салыстырмалы түрде дөңгелек немесе текше пішінді ұяшықтар үшін 1 қатынасы күтіледі (7G-сурет).Жасуша пішінінен басқа, біз β-катенинді бояу арқылы AJ әсерін растадық (7A'-F' сурет).Вортманнинді қолдану арқылы PI3K-AKT жолын тежеу ​​бақылау жасушаларында (7A,C-сурет) және AJ (7A'-сурет) жасуша пішінін өзгерту үшін жеткілікті болды.PI3K-AKT активаторы SC-79 бақылау ұяшықтарындағы ұяшық пішініне (7А, Е-сурет) немесе AJ кеңеюіне (7А'-сурет) әсер етпеді.SPECC1L-kd жасушаларында PI3K-AKT жолының одан әрі басылуы апоптоздың жоғарылауына әкелді (7B,D-сурет) және β-катенинді бояудың айқын жоғарылауына (7В'-сурет), біздің in vivo ауыр мутанттарымызға сәйкес келеді.Маңыздысы, PI3K-AKT жолын белсендіру жасуша пішінін (7B,F-сурет) және AJ фенотиптерін (7B-сурет) айтарлықтай жақсартты.Жасуша пішініндегі өзгерістер жасуша дөңгелектілік қатынасы (CCR) ретінде сандық түрде анықталды және жоғарыда сипатталғандай маңыздылығы бойынша салыстырылды (Cурет 7G).Шынында да, бақылау жасушаларында (сурет 7G, CCR = 1.56) вортманнинмен өңдеу жасуша пішінін айтарлықтай өзгерту үшін жеткілікті болды (сурет 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) байқалғанға ұқсас. SPECC1L ішінде.-kd ұяшықтары (7G-сурет, CCR = 3.46).SPECC1L-kd жасушаларының Вортманнинмен өңделуі (7G-сурет, CCR = 3.60, шамалы) өңделмеген kd жасушаларынан (7G-сурет, CCR = 3.46, болымсыз) немесе вортманнинмен өңделген бақылау жасушаларынан (7G-сурет) маңыздырақ болмады., CCR = 3,46, шамалы) жасушаның ұзаруына қосымша әсер етеді (7G, CCR = 3,61, шамалы).Ең бастысы, SC-79 AKT активаторы SPECC1L-kd жасушаларының ұзартылған фенотипін қалпына келтірді (сурет 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Бұл нәтижелер SPECC1L PI3K-AKT сигналын реттейтінін растайды және SPECC1L орташа төмендеуі жасуша адгезиясына әсер етеді, ал күшті төмендеу апоптозға әкеледі (Cурет 8).
(A–F') PI3K-AKT жолының ингибиторы вортманнинмен (C, D) немесе SC-79 активаторымен (E, F) өңделген бақылау (A, C, E) және SPECC1L-kd (B, D, F) жасушалары Өңдеу .Өңделмеген бақылау жасушалары қалыпты β-мысық жасушалық боялған (A') текше тәрізді (A), ал kd жасушалары ұзартылған (B) β-мысық бояуының жоғарылауымен (B').PI3K-AKT жолын басудан кейін бақылау жасушалары β-мысық кеңеюімен (C') ұзарды (C), ал kd жасушалары біздің жоғары мутацияланған эмбриондарымызға ұқсас және өте күшейтілген β-мысықты көрсете отырып, апоптоздан (D) өте бастады.бояу (D').PI3K-AKT жолын белсендіргеннен кейін бақылау жасушалары текше пішінді (E) болып қалды және қалыпты β-мысық (E') бояуына ие болды, ал kd жасушаларында жасуша пішіні (F) және β-мысық (F') айтарлықтай жақсарды, бұл (G) (AF) ұяшық пішінінің өзгеру дәрежесі MetaMorph бағдарламалық құралын пайдалану арқылы ең ұзын өлшемнің (ұзындық) және сәйкес тік өлшемнің (ені) ұяшықтардың дөңгелектік қатынасының (CCR) көмегімен сандық түрде анықталды.Өңделмеген (NT) SPECC1L-kd жасушалары (CCR = 3,46) бақылау жасушаларынан айтарлықтай ұзағырақ болды (CCR = 1,56, p <6,1 × 10-13).Уорттың бақылау жасушаларында PI3K-AKT жолын тежеуі жасуша пішінінде ұқсас ұзаруды тудыруға жеткілікті болды (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Сол сияқты, SPECC1L-kd жасушаларында SC-79 арқылы AKT белсендіру жасуша ұзаруын бақылау деңгейіне дейін қалпына келтірді (CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).SPECC1L-kd жасушаларының вортманнинмен өңделуі апоптоздың жоғарылауына әкелді, бірақ өңделмеген kd (CCR=3,46, ns) немесе волтманнинмен өңделген бақылау жасушаларымен (3,61) салыстырғанда жасуша пішінінің өзгеруінің (CCR=3,60) одан әрі жоғарылауы байқалмады.ns = маңызды емес.+/- 50 ұяшық үшін SEM өлшемдері көрсетілген.Статистикалық айырмашылықтар Стьюденттің t-тестінің көмегімен есептелді.
(A) PI3K-AKT жолын тежеу ​​мен белсендірудің схемалық көрінісі, нәтижесінде сәйкесінше AJ өзгерістері мен құтқару.(B) SPECC1L арқылы AKT ақуызын тұрақтандырудың ұсынылған үлгісі.
Премиграторлық CNCCs AJ лизисін алдыңғы жүйке қатпарларының нейроэпителиальды жасушаларынан бөлуді қажет етеді1,15,32.AJ компоненттерінің боялуының жоғарылауы және SPECC1L тапшылығы бар жасушаларда in vitro және in vivo апикальды-базальды AJ асимметриялық таралуының жоғалуы SPECC1L-нің β-катенинге физикалық жақындығымен үйлескенде SPECC1L AJ жергілікті тұрақтылығын дұрыс сақтау үшін қызмет ететінін көрсетеді. ұйымдастыру бұлшықеттері.актин цитоскелеті.SPECC1L актин цитоскелетімен және β-катенинмен байланысы және SPECC1L болмаған кезде конденсацияланған актин жіпшелерінің санының артуы AJ тығыздығының байқалған артуына сәйкес келеді.Тағы бір мүмкіндік, SPECC1L жетіспейтін жасушаларда актин талшықтарының көбеюі жасушааралық кернеудің өзгеруіне әкеледі.Жасуша кернеуі AJ 33 динамикасына әсер ететіндіктен, кернеудің өзгеруі көбірек диффузиялық AJ 34 болуы мүмкін.Сондықтан кез келген өзгерістер CNCC қабаттарына әсер етеді.
Wnt1 жүйке қыртысының жасушаларын тудыратын ерте нейрондық қатпарларда көрінеді.Осылайша, Wnt1-cre линиясын бақылау NCC35-ті алдын ала және көшіруді белгілейді.Дегенмен, Wnt1 сонымен қатар ерте нейрондық қатпарлардан алынған дорсальды ми тінінің клондарын белгілейді 35,36, бұл біздің ашық нейрондық қатпарлардағы Wnt1 маркерлері үшін E9.5 мутанттарының бояуы CNCC емес болуы мүмкін.Біздің NCC маркерлерінің AP2A және SOX10 үшін оң бояуы Specc11 мутантты эмбриондарының ашық нейрондық қатпарларында шынымен CNCC бар екенін растады.Сонымен қатар, AP2A және SOX10 ерте көшетін NCC маркерлері болғандықтан, оң бояу бұл жасушалардың E9.5 бойынша стратификацияланбайтын постмиграциялық CNCC екенін көрсетті.
Біздің деректеріміз SPECC1L арқылы AJ молекулалық реттелуі PI3K-AKT сигнализациясы арқылы жүзеге асырылатынын көрсетеді.SPECC1L тапшылығы бар жасушалар мен тіндерде AKT сигналы азаяды.Фантаузцо және т.б.краниофациальды морфогенездегі PI3K-AKT сигнализациясының тікелей рөлін қолдайды.(2014) PDGFRα негізіндегі PI3K-AKT сигнализациясының белсендірілмегендігі таңдайдың жырық фенотипіне әкелетінін көрсетті.Біз сондай-ақ PI3K-AKT жолының тежелуі U2OS жасушаларында AJ және жасуша пішінін өзгерту үшін жеткілікті екенін көрсетеміз.Біздің тұжырымдарымызға сәйкес, Cain et al.37 эндотелий жасушаларындағы PI3K α110 суббірлігінің төмендетілген реттелуі «байланыс индексінің» жоғарылауы деп аталатын периклюзлярлық β-катиннің бояуының ұқсас жоғарылауына әкелетінін көрсетті.Алайда, актин жіптері жоғары деңгейде ұйымдастырылған эндотелий жасушаларында PI3K-AKT жолының басылуы бос жасуша пішініне әкеледі.Керісінше, SPECC1L-kd U2OS жасушалары ұзартылған жасуша пішінін көрсетті.Бұл айырмашылық ұяшық түріне тән болуы мүмкін.PI3K-AKT сигналының басылуы актин цитоскелетіне тұрақты әсер еткенімен, жасуша пішініне әсері орталық актин талшықтарының тығыздығы мен ұйымдасуының өзгеруінен туындаған кернеудің өзгеруімен анықталады.U2OS ұяшықтарында SPECC1L жетіспейтін AJ өзгерісі мен қалпына келтіру маркері ретінде тек ұяшық пішінінің өзгерістерін қолдандық.Қорытындылай келе, біз SPECC1L тапшылығында AKT жолының тежелуі AJ тұрақтылығын арттырады және CNCC-де деламинацияны азайтады деп болжаймыз.
Бір қызығы, pan-AKT деңгейлері SPECC1L болмаған кезде фосфорланған 473-AKT деңгейлеріне қосымша in vitro және in vivo төмендеді, бұл AKT ақуызының тұрақтылығы немесе айналымы деңгейінде PI3K-AKT сигнализациясын реттеуді ұсынады.Opitz/GBBB синдромымен байланысты SPECC1L және MID1 гендері микротүтіктерді тұрақтандыратын ақуыздарды кодтайды 18,22.SPECC1L және MID1 микротүтікшелерді тұрақтандыруға делдал болатын механизм толық түсінілмеген.SPECC1L жағдайында бұл тұрақтандыру микротүтікшелердің 18 ішкі жиынының күшейтілген ацетилденуін қамтиды.SPECC1L AKT сияқты басқа ақуыздарды тұрақтандыру үшін ұқсас механизмді қолдануы мүмкін.АКТ ақуызындағы лизин қалдықтарының ацетилденуі мембрананың локализациясы мен фосфорлануының төмендеуіне әкелетіні көрсетілген38.Сонымен қатар, оның мембраналық локализациясы және активтенуі үшін K63 тізбегінің AKT-дегі сол лизин қалдығында убиквитинациясы қажет39,40.Әртүрлі жоғары өнімді ашытқы екі гибридті экрандарда анықталған SPECC1L ақуыздарымен әрекеттесетін бірнеше факторлардың ішінде төртеуі – CCDC841, ECM2942, APC және UBE2I43 – ақуыз айналымына немесе убиквитинация немесе сумойлизация арқылы тұрақтылыққа қатысты.SPECC1L AKT тұрақтылығына әсер ететін AKT лизин қалдықтарының трансляциядан кейінгі модификациясына қатысуы мүмкін.Дегенмен, AKT протеинінің локализациясы мен тұрақтылығындағы SPECC1L маңызды рөлі әлі де анықталуы керек.
SPECC1L экспрессиясындағы ауыр ақаулар in vivo AJ маркері бояуының жоғарылауына және ақаулы CNCC қабаттасуына, сондай-ақ апоптоздың жоғарылауына және ерте эмбриональды өлімге әкелді.Алдыңғы есептер апоптоз деңгейі жоғары тышқан мутанттарының жүйке түтігінің ақауларымен 44,45,46,47 және бас сүйек-бет ақауларымен48 байланысты екенін көрсетті.Нейрондық қатпарлардағы немесе фарингальды доғалардағы шамадан тыс жасушалардың өлімі дұрыс морфогенетикалық қозғалыс үшін қажетті жасушалардың жеткіліксіз санына әкелуі мүмкін деген болжам бар 48,49,50.Керісінше, орташа төмендеген SPECC1L экспрессиясы бар SPECC1L жетіспейтін жасуша линиялары жасуша өлімінің жоғарылауының дәлелінсіз тек AJ өзгерістерін көрсетті.Дегенмен, осы Kd жасушаларында PI3K-AKT жолының химиялық тежелуі апоптоздың жоғарылауына әкелді.Осылайша, SPECC1L экспрессиясының немесе функциясының қалыпты төмендеуі жасушаның өмір сүруін қамтамасыз етеді.Бұл ст.E9.5 — генді түсіру тиімділігінің төмендеуіне байланысты — жүйке түтіктерін жауып, кейінірек дамуды тоқтата алады, көбінесе бас сүйек-бет ақаулары бар (S3-сурет).Сондай-ақ гетерозиготалы Specc1l эмбриондарының бассүйек-бет аномалиялары бар сирек кездесуі, мүмкін генді түсіру тиімділігінің жоғарылауымен байланысты, сондай-ақ зебрабалықтардағы табылған екі SPECC1L ортологының (specc1lb) бірі кеш эмбриональды фенотиптердің жоғалуын қоса алғанда, осыған сәйкес келеді. төменгі жақ және екі жақты жырықтар51.Осылайша, адам пациенттерінде анықталған гетерозиготалы SPECC1L функцияларын жоғалту мутациялары бассүйек-бет морфогенезі кезінде SPECC1L функциясының кішігірім бұзылыстарын тудыруы мүмкін, бұл олардың ауыз-бет саңылауларын түсіндіруге жеткілікті.SPECC1L негізіндегі жасушааралық байланыстарды реттеу жұтқыншақ доғаларының палатогенезінде және бірігуінде де рөл атқаруы мүмкін.SPECC1L функциясын одан әрі зерттеу нейроэпителиальды жасушалардың қозғалғыштығында және краниофациалды морфогенезде жүйке түтігінің жабылуы кезінде CNCC-дегі уақытша жасушааралық контактілердің рөлін анықтауға көмектеседі.
U2OS остеосаркома бақылауы және SPECC1L-kd жасушалары бұрын сипатталған (Саади және басқалар, 2011).SPECC1L-ге қарсы антиденелер де бұрын сипатталған (Саади және басқалар, 2011).Анти-β-катиндік антиденелер (қоян; 1:1000; Санта-Крус, Даллас, TX) (тышқан; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), миозин IIb (1:1000; Сигма-Олдрих, Сент-Луис ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Сан-Диего) , Калифорния), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 3-ші каспазаны (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) және β-актинді (1:2500; Sigma-Oldrich, St. Louis, MO ) сипатталғандай пайдаланылды..Актин жіптері Acti-дақ родаминдік фаллодинмен боялған (Цитоскелет, Денвер, Колорадо).
U2OS бақылау жасушалары және SPECC1L-kd жасушалары 10% ұрықтың ірі қара сарысуымен толықтырылған стандартты жоғары глюкоза DMEM-де өсірілді (Life Technologies, Carlsbad, CA).AJ өзгерістері үшін 2 x 105 ұяшық 0,1% шошқа желатинімен өңделген шыныға себілді (Сигма-Олдрих, Сент-Луис, МО) және жасуша пішінінің өзгеруіне бақылау жасалды.Жасушалар әр түрлі көрсетілген уақыт нүктелерінде жиналды: тұқым себуден кейін 4 сағаттан кейін (t = 1), егілгеннен кейін 24 сағаттан кейін (t = 2), жасуша пішінінің өзгеріссіз қосылуы (t = 3), жасуша пішінінің өзгеруі (t = 4) , жасуша пішіні өзгергеннен кейін 24 сағаттан кейін (t = 5) және жасуша пішіні өзгергеннен кейін 48 сағаттан кейін (t = 6) (1, 2, 3-сурет).PI3K-AKT жолын модуляциялау үшін жасушалар PI3K-AKT ингибиторы вортманнинмен (TOCRIS Biosciences, Миннеаполис, Миннесота) немесе SC-79 активаторымен (TOCRIS Biosciences, Миннеаполис Адамс, Миннесота) көрсетілген концентрацияларда өсірілді.Химиялық заттар бар орта күн сайын ауыстырылды.
Кәдімгі культура жағдайында тірі бақылау және KD жасушаларында кадр-кадр жазбалары жасалды және фазалық контрастты суреттер 7 күн бойы әрбір 10 минут сайын жиналды.Суреттер QImaging Retiga-SRV камерасына қосылған механикалық кезеңмен және 10 × N-PLAN объектісімен жабдықталған компьютермен басқарылатын Leica DM IRB инверттелген микроскоптың көмегімен алынды.Бейнелеу кезінде жасуша дақылдары 5% СО2 бар ылғалды атмосферада 37°C температурада ұсталды.
Аймақтық мутант тінтуірінің ресурстық орталығынан (UC Davis, CA) екі ген тұзағы ES жасуша желісі DTM096 және RRH048 Specc1lgtDTM096 және Specc1lgtRRH046 деп белгіленген Specc11 жетіспейтін тінтуір желілерін жасау үшін пайдаланылды.Қысқаша айтқанда, 129/REJ ES жасушалары C57BL6 бластоцисталарына енгізілді.Алынған химерлі еркек тышқандар агути қабық түсі бар ұрпақтарды анықтау үшін аналық C57BL6 тышқандарымен өсірілді.Гетерозиготаларды анықтау үшін гендік тұзақ векторының кірістірулерінің болуы пайдаланылды.Тышқандар 129/REJ;C57BL6 аралас фонында ұсталды.Генетикалық тұзақ векторының кірістіру орнының орны RT-ПТР, геномды реттілік және генетикалық комплементация арқылы расталды (қосымша 1 сурет).Қос гетерозиготалы Specc1lGT тышқандарының CNCC тегін қадағалау үшін ROSAmTmG (#007576) және Wnt1-Cre (#003829) тышқандары (Джексон зертханасы, Бар Харбор, ME) ROSAmTmG және Wnt1-Cre аллелентін алу үшін айқастырылды.Тышқандардағы барлық эксперименттер Канзас медициналық орталығының университетінің жануарларды күту және пайдалану жөніндегі институционалдық комитеті бекіткен хаттамаларға сәйкес орындалды.
Эмбриондар (1% формальдегид, 0,2% глутаральдегид, 2 мМ MgCl2, 0,02% NP-40, 5 мм EGTA) бөлме температурасында 60 минут бойы бекітілді.X-gal бояу ерітіндісінде (5 мМ калий феррицианиді, 5 мМ калий ферроцианид, 2 мМ MgCl2, 0,01% натрий дезоксихолат, 0,02% NP-40, 1 мг/мл X-гал) бекіткеннен кейін дақтарды дамыту 37°C температурада орындалды. .°C 1-6 сағат ішінде.Эмбриондар 4% PFA-да бекітілген және визуализацияланған.
Western blotting үшін жасушалар HALT протеаза тежегіштерінің қоспасымен толықтырылған пассивті лизис буферінде (Promega, Fitchburg, WI) лизиске ұшырады (Сигма-Олдрих, Сент-Луис, МО).Лизаттар 12% полиакриламидті Mini-PROTEAN TGX дайын гельдерінде (Bio-Rad, Hercules, CA) өңделді және Immobilon PVDF мембраналарына (EMD Millipore, Billerica, MA) ауыстырылды.Мембрана 0,1% Tween бар PBS құрамында 5% сүтте бітеліп қалды.Антиденелер түнде 4°C температурада немесе бір сағат бойы бөлме температурасында инкубацияланды.Femto SuperSignal West ECL реагент (Thermo Scientific, Waltham, MA) сигнал генерациялау үшін пайдаланылды.Иммунды бояу үшін эмбриондар түні бойы 4% PFA/PBS ішінде бекітіліп, криоконсервацияланды.Тіндердің криосекциялары құрамында 1% қалыпты ешкі сарысуы (Thermo Scientific, Waltham, MA) және 0,1% Triton X-100 (Sigma-Oldrich, Сент-Луис, МО) бар PBS-де блокталды, содан кейін инкубаторда 4°C температурада инкубаторда инкубацияланды. түн.антиденемен және флуоресцентті қайталама антиденемен (1:1000) 4°С температурада 1 сағат.Боялған кесінділер ProLong алтын ортасына (Thermo Scientific, Waltham MA) орналастырылды және Leica TCS SPE конфокальды микроскопы арқылы жалпақ кескіндер алынды.Әрбір иммундық бояу кем дегенде екі мутантты эмбриондардың цироссекцияларында үш тәуелсіз эксперимент ретінде орындалды.Өкілетті эксперимент көрсетіледі.
Жасушалар модификацияланған RIPA буферінде инкубацияланды (20 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 1% NP-40, 130 мМ NaCl, 10% глицерин, 2 мм EDTA және HALT протеаза ингибиторы (Сигма-Олдрих, Сент-Луис, МО) Қысқаша айтқанда, лизаттар G протеинінің магниттік моншақтарымен (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) алдын ала тазартылды, содан кейін түнде 4° C температурада инкубацияланды. SPECC1L немесе IgG протеиніне қарсы G протеинді түйіршіктері бар SPECC1L экстракциясы үшін пайдаланылды және антиблотинг арқылы Western Blotting жүргізілді. Жоғарыда сипатталған -β-катин антиденесі Көрсетілген co-IP эксперименттері төрт тәуелсіз эксперименттің өкілі болып табылады.
Бекітілген өсірілген жасушалар немесе тінтуірдің эмбриондық тіндері Канзас университетінің медициналық орталығындағы электронды микроскопия орталығына берілді.Қысқаша айтқанда, үлгілер EMbed 812 шайырына (Электрондық микроскопия ғылымдары, Форт Вашингтон, Пенсильвания) ендірілген, 60°C температурада түнде полимерленген және алмас пышақпен жабдықталған Leica UC7 ультрамикротомы арқылы 80 нм кесінді.Бөлімдер 100 кВ Lab6 зеңбірекімен жабдықталған JEOL JEM-1400 трансмиссиялық электронды микроскоптың көмегімен визуалды.
Бұл мақаланы қалай келтіруге болады: Wilson, NR et al.SPECC1L тапшылығы түйіскен буындардың тұрақтылығының жоғарылауына және бассүйек нерв қыртысының жасушаларының деламинациясының төмендеуіне әкеледі.ғылым.6, 17735;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
Сент-Жан, Дж.-П.Жүйке қыртысының индукциясы және дифференциациясы.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Кордеро, ДР және т.б.Қозғалыстағы бас сүйек-ми жүйке жасушалары: олардың бассүйек-бет дамуындағы рөлі.Американдық медициналық генетика журналы.Бөлім A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Боланд, Р.П. Нейрокристопатия: оның 20 жыл бойы өсуі мен дамуы.Педиатр.патология.зертхана.дәрі.17, 1–25 (1997).
Манголд Е., Людвиг К.У және Нотен М.М. Орақ-бет жырықтарының генетикасындағы серпіліс.Молекулалық медицинадағы үрдістер 17, 725–733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Мину, М. және Райли, ФМ Бассүйек-беттік даму кезінде бассүйек нейрондық қыртыс жасушаларының миграциясы мен үлгілеуінің молекулалық механизмдері.Әзірлеу 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Диксон, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH және Murray, JK Жарық ерін және таңдай: генетикалық және қоршаған орта әсерлерін түсіну.табиғи түсініктеме.Генетика 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Интерферонды реттейтін фактор-6 (Irf6) тапшылығы бар тышқандардағы терінің, аяқ-қолдардың және краниофациалды аймақтың қалыптан тыс морфогенезі.Ұлттық Генетта.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3-тегі басым мутациялар ван дер Ваорд синдромын тудырады және ауыз қуысының перидермасының дамуын бұзады.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ және Juriloff, DM Жүйке түтігінің жабылуында ақаулары бар тінтуір мутанттарының тізімін жаңартыңыз және жүйке түтігінің жабылуын толық генетикалық түсінуге қарай прогресс.Туа біткен ақауларды зерттеу.А бөлімі, Клиникалық және молекулалық тератология 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-делдалдық PDGFRalpha сигнализациясы p53-тәуелді жасушаішілік жол арқылы қаңқа дамуындағы өмір сүруді және пролиферацияны реттейді.Геннің дамуы 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND және Murdoch, JN Disheveled: конвергентті кеңеюдің жүйке түтігінің жабылуына қатынасы.Неврологиядағы тенденциялар.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).