347 тот баспайтын болаттан жасалған ширатылған түтіктің химиялық құрамдас бөлігі, крест-байланыстырылған масс-спектрометрияны (CLMS) пайдалана отырып, жаңа интерферонға жауап беретін адам лейкоциттік антиген-А (HLA-A) шаперон ақуыздарын анықтау

Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Әр слайдта үш мақаланы көрсететін слайдерлер.Слайдтар арқылы жылжу үшін артқа және келесі түймелерді немесе әр слайд бойынша жылжу үшін соңында слайд контроллері түймелерін пайдаланыңыз.

Өнім Сипаттамасы

Тот баспайтын болаттан жасалған 347L катушка түтіктері, болат дәрежесі: SS347L

Интерферон сигнализациясы жүйесі қоршаған ортадан патогендік және ішкі патологиялық патологиялық сигналдардың кең спектріне реакцияны тудырады, нәтижесінде интерферонмен жұмыс істейтін ақуыздардың жиынтығы пайда болады.Біз DSS-делдалдық массалық массалық масс-спектрометрияны (CLMS) қолдандық.Күтілетін интерферонмен жұмыс істейтін ақуыздардан басқа, біз MX1, USP18, OAS3 және Stat1 сияқты канондық интерферонмен байланыстырылған ақуыздардың романаралық және интрамолекулалық емес қосымшаларын анықтадық.Біз Co-ImphunoPripation көмегімен HLA-Alootines (H2BFS-HLA-A-HMGA1) романының ортогональды дәмін таттық, бірлескен иммундықопрессияны қолдана отырып, оларды молекулалық динамиканы модельдеуді қолдана отырып зерттеу.Ақуыз кешенінің конформативті динамикасын модельдеу бірнеше өзара әрекеттесу учаскелерін анықтады, олар CLMS-тің нәтижелерінде анықталған өзара әрекеттесуді көрсетті.Бірлесіп, біз Clms компаниясының пилоттық зерттеуін ұсынамыз және Interfer-ге сәйкес келетін жаңа сигналдық кешендерді ұсынамыз және климлерді ақуызды қолдануды асыға күтеміз және микроэкиондық белсендектің жаңа динамикасын анықтауға асыға күтеміз.
Адаптивті иммундық жауап басталмас бұрын, иесінің туа біткен қорғаныс жүйесі интерферондар (IFNs) деп аталатын секрецияланған альфа-спиральді цитокиндер тобы арқылы жүзеге асырылатын микробқа қарсы жауап береді.I типті IFN класстары IFNα және IFNβ вирусқа қарсы, проапоптотикалық, қабынуға қарсы және антипролиферативті күйлерді қоса, жасушалық жауаптарды белсендіреді.Жақында жүргізілген зерттеу IFNα14 канондық IFNα2 қосалқы түрімен салыстырғанда HBV2 және HIV-13,4 репликациясын шектейтін ең тиімді изоформалардың бірі екенін көрсетті.
Белсендірілген I типті интерферон рецепторлық кешендері (IFNAR1 және IFNAR2) Янус киназалары TYK2 және JAK15,6 делдалдық сигнал беру каскадын іске қосатыны анықталды.Бұл Janus киназалары SH2 домені арқылы гетеродимеризацияны бастау үшін тирозин қалдықтарында сигнал түрлендіргіштерін және транскрипциялық ақуыз активаторларын (STAT1 және STAT2) фосфорлайды6.Кейіннен IRF9 IFN-стимуляцияланған фактор 3 генінің (ISGF3) тримерлік кешенін құру үшін STAT гетеродимерлерін байланыстырады, ол ядроға ауысады және 2000-нан астам интерферонмен ынталандырылған гендердің (ISGs) транскрипциясын индукциялайды5,6,7,8.
Вирустық инфекциядан қорғаныстың бірінші желісі ретінде жасушалар биологиялық белсенділіктің кең ауқымы бар жасушалық ақуыздардың кең өзара әрекеттесуін жылдам орналастырады.Бұл ақуыздарға үлгіні тану рецепторлары, сигналдық молекулалар, транскрипция факторлары және тікелей вирусқа қарсы функциялары бар ақуыздар, сондай-ақ иммундық жауаптардың теріс реттеушілері9 кіреді.ISG белсенділігі туралы ақпараттың көп бөлігі шамадан тыс экспрессиялық экрандарды 10,11 немесе генді өшіру әдістерін (siRNA, RNAi және CRISPR)12,13 пайдаланатын функционалды экрандардан келеді, онда жеке ISG экспрессиясы немесе тежелуі және олардың белсенділігі әртүрлі вирустарда тексеріледі.Бұл зерттеулер жеке ISG вирусқа қарсы қасиеттерін анықтағанымен, әрбір ISG негізгі молекулалық механизмдері негізінен белгісіз болып қала береді.Толық белсенділікті қамтамасыз ету үшін көптеген ақуыздар бір немесе бірнеше цитокиндермен әрекеттеседі, сондықтан не ISG тікелей әрекеттеседі, не олардың өзара әрекеттесуі жасушалық ақуыздар арқылы жүзеге асады деп жалпы қабылданған.Мысалы, жақында жасалған фотокросс-байланыстырылған протеомика зерттеуі ATPase VCP/p97 негізгі IFITM3 өзара әрекеттесу серіктесі ретінде анықталды, оның тежелуі лизосомалық сұрыптау, IFITM3 айналымы және вирустық бөлшектермен 14 котасымалдауда ақауларға әкеледі.Иммунопреципитацияны пайдалана отырып, біз VAPA-ны, весикулдармен байланысты ақуызды IFITM1/2/3-пен өзара әрекеттесу серіктесі ретінде анықтадық, ол холестерин арқылы вирустық жетілуге ​​делдалдық етеді және бұл ашытқы екі гибридті жүйені қолданатын басқа зерттеумен расталды.Ғылыми қамтамасыз ету 15, 16.
Инфекцияны басуға және қатерлі трансформацияға қатысатын іргелі биологиялық процесс негізгі гистосәйкестік кешені (MHC) молекулалары арқылы жүзеге асырылатын антигенді ұсыну болып табылады.Бөлінген, мерзімінен бұрын тоқтатылған немесе қате қатпарланған ақуыздардан алынған пептидтер (ұзындығы 8-12 аминқышқылдары) MHC-I гетеродимеріне жүктеледі (β-2-микроглобулин деп аталатын MHC-I ауыр және жеңіл тізбектерден тұрады; β2M) 17,18 .Алынған тұрақты MHC-I тримерлері жасуша бетіне тасымалданады, онда олар жасушаішілік пептидтерді CD8+ Т жасушаларына (цитотоксикалық Т жасушалары) береді17.Т-клеткалар бұл патогендерді және ісікке тән антигенді тасымалдаушы жасушаларды таниды және жояды.Демек, патогендер мен ісік жасушалары иммундық бақылауды болдырмау үшін антигенді ұсыну процесін жиі басады.Сонымен қатар, MHC-I адам ісіктерінің 40-90% төмендетілген және жиі нашар болжаммен байланысты19.
Сондықтан, бірнеше жасушалық ақуыздар қысқа уақыт ішінде жоғары IFN сұранысына жауап беруге қатысады, соның ішінде промотор хроматинінің 20,21 модификациясы мен модификациясы бар.Интерферон сигналының күрделілігі мен уақытқа тәуелді динамикасын қарастырған кезде екі сұрақ туындайды: (i) жылдам сигнал беруге қатысатын көп ақуызды кешендерді тұрақтандыру және ұстау мүмкін бе және (ii) бұл өзара әрекеттесулерді 3D кеңістігінде бейнелеуге бола ма?
Осы мәселелерді шешу үшін біз IFNα-индукцияланған ақуыздың әрекеттесу желісін және оның динамикасын зерттеу үшін масс-спектрометриямен (CLMS) біріктірілген дисукцинимидті субераттық химиялық кросс-байланыстыруды (DSS) енгіздік.DSS in vivo ақуыздардың және/немесе ақуыз кешендерінің проксимальды қалдықтары арасындағы коваленттік байланыстарды қосады.Кейінгі MS талдауы ішкі байланыстар деп аталатын белгілі бір ақуыздың ішіндегі аймақтардың кеңістіктік жақындығын немесе өзара байланыс деп аталатын ақуыз кешендерінің суббірліктерін көрсететін нақты кросс-байланыс тораптарын көрсетеді.Осы тәсілді пайдалана отырып, біз бірнеше жаңа ақуыз-белок кешендерін, сондай-ақ интерферонмен индукцияланған мультипротеиндік өзара әрекеттесу желілерін анықтадық.Осы жаңа өзара әрекеттесулердің ішкі жиынын әрі қарай сынау арқылы біз H2BFS (H2B гистон түріндегі FS; бұдан әрі H2B деп аталады) және MDN1 HLA-A үшін байланыстырушы серіктестер ретінде әрекет ететінін көрсетеміз.
Flo-1 жасушалары өңеш аденокарциномасының ең танымал in vitro үлгілерінің бірі болып табылады, өйткені олар өңеш ісіктерінің негізгі ерекшеліктерін еліктейді22,23.Дегенмен, барлық ісіктер иммуногенді емес және Flo-1 жасушаларының интерферонмен емдеуге жауап беретінін анықтау үшін біз Flo-1 жасушаларын 10 нг/мл IFNα 72 сағат бойы өңдедік.Flo-1 жасушалары емдеуден кейін 2 сағаттан кейін басталып, 72 сағат бойы жалғасатын, IRF1 стационарлық деңгейлерінің уақытқа байланысты төмендеуімен pSTAT1 және IRF1 ерте индукциясын көрсетті (1А сурет).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2 және ISG15) IFNα-ға классикалық орта және кеш фазалық жауаптарды имитациялай отырып, 6 сағаттан кейін қатты индукцияланғаны анықталды (1А-сурет).Бұл деректер бірге бұл жасушалық модельді интерферон реакцияларын зерттеу үшін пайдалануға болатынын көрсетеді.
(A) 2, 6, 24, 48 және 72 сағат бойы 10 нг/мл IFNα өңделген Flo-1 жасушаларындағы ақуыз экспрессиясы көрсетілген ISG антиденелерін пайдаланып иммуноблот арқылы талданды.(C) Р53(DO-1) антиденелерімен протеиннің өзара байланысу дәрежесін бағалау үшін репрезентативті иммуноблот зерттелді.
In situ протеиннің өзара әрекеттесу ландшафтын түсіру үшін біз мембрананың жоғары өткізгіштігіне және салыстырмалы түрде қысқа реакция уақытына байланысты кеңінен қолданылатын кросс-байланыстырушы агентті DSS қолдандық.Қысқарақ реакция уақыты айқаспалы байланысқан ақуыздардың үлкен агрегаттарының түзілуін болдырмауға көмектеседі, осылайша айқаспалы байланыстырғыштың тұрақтылығын сақтайды.Оңтайлы DSS концентрациясын анықтау және шамадан тыс байланыстыруды болдырмау үшін біз алдымен ұяшықтарды 5, 2,5 және 1 мМ DSS әсеріне сәйкес 5, 10, 5 және 30 минут бойы әсер еттік және лизаттарды Coomassie-боялған SDS-PAGE арқылы талдадық. (деректер көрсетілмеген).Жасуша лизаттары ең төменгі концентрацияда және ең қысқа уақыт нүктесінде жоғары айқаспалы байланысқан болып көрінеді.Сондықтан DSS 5 минут ішінде 1, 0,5 және 0,1 мМ титрленді (1В-сурет).5 минут ішінде 0,5 мМ DSS көмегімен оңтайлы айқаспалы байланыс байқалды және бұл шарттар IFNα өңделген жасушалар үшін таңдалды.Сонымен қатар, 1С суретте ақуыздың кросс-байланыс дәрежесін бағалау үшін p53 (DO-1) антиденесінің көмегімен орындалған Western Blot көрсетілген.
Flo-1 жасушалары айқас байланыстырғышты қоспас бұрын 24 сағат бойы 10 нг/мл IFNα-мен өңделген.Кросс-байланыстырылған жасушалар кейіннен екі сатылы протеолиз арқылы лизиске ұшырады және ақуыздар FASP арқылы өңделді (2-сурет)24,25.Айқас байланысқан триптикалық пептидтер масс-спектрометрия арқылы талданды (2-сурет).Содан кейін MS/MS спектрлері ақуыз тізбегіне сәйкестендіріледі және MaxQuant26,27 арқылы сандық бағаланады.Алынған спектрлерден SIM-XL бағдарламасының көмегімен өзара байланысқан пептидтер анықталды, ал жеке қосылыстар xQuest28 және SIM-XL29 ашық бастапқы компьютерлік бағдарламалық қамтамасыз ету құбырларының көмегімен күрделі желіге біріктірілді (2-сурет).SIM-XL қарапайым немесе күрделі ақуыз қоспаларындағы протеин-белок әрекеттесулерін, ішкі тізбектерді және жеке тізбектерді анықтайды және ақуыз құрылымдарындағы өзара әрекеттесулерді визуализациялау үшін сценарийлерді ұсынады.Бұған қоса, ол MS/MS29 спектрінің сапасына сәйкес әрбір айқас сілтемені ID ұпайы ретінде бағалайды.Бірнеше жоғары сенімді ақуыз-белок өзара әрекеттесулері мен кешендері анықталды және молекулалық динамикалық (МД) модельдеу (2-сурет) 30, 31 арқылы комплекстердің коиммунопреципитациясы мен конформациялық өзгерістері арқылы өзара әрекеттесулердің жаңа жиынтығы одан әрі зерттелді.
CLMS әдісіне схемалық шолу.Flo-1 жасушалары 24 сағат бойы 10 нг/мл IFNα өңделді, содан кейін DSS көмегімен in situ протеинді айқастыру, содан кейін жасуша лизисі және трипсинациясы жүргізілді.Айқас байланысқан үлгілер Orbitrap масс-спектрометрі арқылы талданды және одан әрі LC-MS/MS кезінде пептидті прекурсорлардың фрагментациясы үшін сынама алынды.Алынған спектрлерден екі байланысқан пептидтер Crosslinked Peptides (SIM-XL) бағдарламасының Спектрді тану машинасының көмегімен анықталды және барлық қосылыстар есептеу құбырларының көмегімен күрделі желіге біріктірілді.Жалған оң көрсеткіш (FDR) ұпайлары негізінде сенімділігі төмен өзара әрекеттесулерді сүзіңіз.Бірқатар жаңа жоғары дәлдіктегі ақуыз-белок өзара әрекеттесулері коиммунопреципитацияны қолдану арқылы әрі қарай расталды және комплекстердегі конформациялық өзгерістер молекулалық динамикалық (MD) модельдеу арқылы зерттелді.
Барлығы ~30,500 және ~28,500 пептидтер MaxQuant көмегімен ынталандырылмаған және ынталандырылған IFNα үлгілерінде анықталды (Қосымша кесте S1, 3A сурет).Екі жағдайда да пептидтердің ұзындығының таралуы үлкенірек пептидтердің жоғары үлесін көрсетті, бұл кросс-байланыстырылған пептидтердің болуын көрсетеді (Cурет 3B,C).Бұған қоса, IFNα өңделген үлгілерде 40-55 диапазонында үлкенірек пептидтердің үлкен бөлігі болды (3C-сурет).Log2 қарқындылығымен протеинді салыстыру классикалық интерферонмен ынталандырылған ақуыздардың MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 және HLA-F (3D-сурет) сияқты өңделмеген үлгілермен салыстырғанда ең көп екенін көрсетті.Reactome жолының дерекқорын пайдалана отырып, IFNα еміне жауап ретінде үш еседен астам байытылған белоктарға арналған жолдарды талдау MHC-I арқылы антигенді ұсыну және өңдеу ең басым жол екенін көрсетті (3E-сурет).Бұрынғы есептерге сәйкес, белсендірілген жолдар арасында OAS және ISG15, сондай-ақ IFNα/β және цитокиндік сигналдар арқылы жасалған вирусқа қарсы жауаптар болды.Сонымен қатар, SIM-XL көмегімен бастапқы алынған MS/MS спектрлерінен лизин және серин-спецификалық ақуыздың айқаспалы байланыстары анықталды.Жақында жүргізілген зерттеу 5 жасуша түріндегі ISG шамадан тыс экспрессиясының жеке зерттеулерін мета-талдау арқылы 9 вирус класындағы 20 вирусты қамтитын 104 ISG туралы хабарлады9.Дегенмен, үлкен деректер жиынын скринингтің есептеу шектеулерін еңсеру үшін біз Padaria және т.б. хабарлаған IRDS гендерінің тізімі арасындағы ықтимал өзара әрекеттесулерді зерттеу үшін кішірек деректер жиынынан бастадық, олардың көпшілігі ISG болып табылады.
IFNα-ға жауап ретінде дифференциалды экспрессияланған кросс-байланыстырылған ақуыздарды анықтау (MaxQuant-тан алынған деректер).(A) IFNα14 өңделген және өңделмеген Flo-1 үлгілерінде анықталған жалпы және эксклюзивті пептидтердің санын көрсететін Венн диаграммасы.Өңделмеген (B) және IFNα өңделген (C) көлденең байланысқан үлгілердің пептид ұзындығының таралуы.(D) Өңделмеген және IFNα14 өңделген Flo-1 жасушалары арасындағы log2 (LFQ қарқындылығы) көрсететін жылу картасы.Сол жақ панель IFNα қатысуымен ең белсенді белсендірілген ақуыздарды көрсетеді.(E) IFNα емдеуден кейінгі 20 негізгі байыту жолдарын көрсететін гистограмма.Reactome жолының дерекқоры реттелетін IFNα-жауап беретін ақуыздардағы төрт еседен астам өзгерістерге талдау жасады.
Interferon-дің озылған ынталандыру жақсы құжатталған, бірақ молекулалық деңгейде бұл ақуыздардың биологиялық функциялардың кең спектрінде қалай төмендетілгенін түсініледі.Біз Белгілігілердің танымал əрігілерімен ақуыздың өзара әрекеттесуін зерттедік.Бір қызығы, біз MX1, USP18, ROBO1, OAS3 және STAT1 ақуыздарын қамтитын желіні анықтадық, олар IFNα емдеуге жауап ретінде үлкен кешен құрайды (4-сурет, S2 кесте) 32,33,34.Ең бастысы, бұл өзара әрекеттесулер IFNα-мен өңделген барлық үш көшірмеде табылды және өңделмеген үлгілерде табылмады, бұл олардың IFNα емдеуіне жауап ретінде арнайы қалыптасқанын көрсетеді.Стат1 осы ISGS-тің өрнегін транскрализациялайтыны белгілі, бірақ оның ақуыз деңгейіндегі ISGS-пен өзара әрекеттесуі зерттелмегені белгілі.STAT1 кристалдық құрылымы оның спиралді доменінің (CCD) димерлердің түзілуі кезінде ДНҚ немесе протомерлермен әрекеттесуіне қатыспайтынын көрсетті35.Бұл α-Clients 35-те пайда болуы үшін негізінен гидрофильді беттік аймақты қамтамасыз ететін доңғалақты ерік құрылымын құрайды.Біздің CLMS деректерімізде біз STAT1-мен өзара әрекеттесулердің көпшілігі CCD, сілтеме домені немесе C-терминал құйрығы (қалдықтар 700-708) алдындағы SH2 доменінде болғанын байқадық (4А-сурет).Алдыңғы зерттеу USP18 STAT2 және ДНҚ байланыстырушы доменіне (DBD) байланыстырылғанын және I интерферон рецепторы IFNAR2 типті Itnar2 Tyne Conferon дабылы 24 типті деп санайды.Біздің деректеріміз сонымен қатар USP18 каталитикалық домені Stat1 DBD-мен әрекеттеседі, деп мәлімдеді STAT1 және Stat2-де STAT1 және Stat2 USP18-де USP18-ге қатысты рөл атқара алады деп болжайды.
IFNα-мен өңделген кросс-байланыстырылған жасушаларда анықталған ақуыз-белок ISG желісі.(A) 2D өзара әрекеттесу графигі белок пен ақуыздың өзара әрекеттесуін (SIM-XL бағдарламасында жасалған), молекулааралық өзара әрекеттесуді білдіретін сызықтармен (айқаспалы байланыстың үзілуі 3,5-ке орнатылған).Әртүрлі сәйкестіктердің домендері түсімен белгіленеді32: MX1 домені, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) және GED (569–660).OAS3 домендері: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) және OAS1_C (903-108).Домен ROBO1, Ig_3 (67–151), I-жиын (170–258), I-жиын (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) және fn3 (777–864).STAT1 өрістері: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) және STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Сәйкесінше көк және қызыл түспен белгіленген өзара әрекеттесулері мен өзара әрекеттесуі бар көлденең байланысқан ақуыздардың (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 және STAT1) айналмалы қарау құралы.Көлденең байланыс шегі 3,5 болып белгіленді.Нүктелер сюжеттері MX1 (C), USP18 (D), Robo1 (E) және OAS3 (F), сондай-ақ oas3 (f), сонымен қатар екі пептидтер арасындағы k немесе in-мен өзара әрекеттесу сайттарын көрсетеді.Суретте кросс-байланыс ұпайының шегі 3,0 болып белгіленген.(G) Стат1 мен OAS3 диомендері арасындағы түрлі өзара әрекеттесу учаскелері PIMOL-дегі ақуыздық құрылымдармен (PIMOL MOLECULAL GROGINS жүйесі, 2,0 нұсқасы, 2,0 нұсқасы);STAT1 (pdb идентификаторы: 1bf533) және OAS3 (pdb идентификаторы: 4s3n34).) бағдарламасы.
Адамдарда USP18 екі изоформасы сипатталған, негізінен ядрода орналасқан толық ұзындықтағы ақуыз және N-терминал домені жоқ изоформа USP18-sf, ол цитоплазмада және ядрода біркелкі таралған 36 .Сонымен қатар, N-терминусы құрылымсыз деп болжанған және изопептидаза белсенділігін немесе ISG1537 байланысуын қажет етпейді.Біздің зерттеуімізде анықталған өзара әрекеттесулердің көпшілігі ақуыздың N-терминусында орналасқан, бұл өзара әрекеттесулер толық ұзындықтағы USP18 (4A, D сурет) қамтиды және осылайша ядрода орын алуы мүмкін деп болжайды.Сонымен қатар, біздің деректеріміз N-терминусының ақуыз бен ақуыздың өзара әрекеттесуіне мамандандырылған екенін көрсетеді.IFNAR2 байланыстыру орны 312-368 қалдықтары арасында орналасқан және атап айтқанда, кешендегі ақуыздардың ешқайсысы осы аймақпен байланыспайды (4А-сурет) 37,38 .Бірге алынған бұл деректер IFNAR2 байланыстыру доменін тек рецепторлық ақуыз арқылы пайдаланатынын көрсетеді.Бұған қоса, тек OAS3 және ROBO1 N-терминусының және IFNAR2 байланыстыру торабының жоғары ағынындағы домендермен байланысты екені анықталды (4А-сурет).
ROBO1 трансмембраналық сигналдық молекулалардың иммуноглобулиндердің (Ig) суперфамилиясына жатады және жасушадан тыс аймақта бес Ig доменінен және үш фибронектин (Fn) доменінен тұрады.Бұл жасушадан тыс домендерден кейін мембрана-проксимальды аймақ және жалғыз трансмембраналық спираль 39. Құрылымы жоқ жасушаішілік аймақ C-соңында орналасқан және ақуыздың эффекторлық байланысуына делдалдық жасайтын сақталған реттілік мотивтерін қамтиды39.~1100-ден 1600-ге дейінгі аминқышқылдарынан тұратын аймақ негізінен ретсіз.Біз MX1 ROBO1-мен Ig, Fn және жасушаішілік домендер арқылы өзара әрекеттесетінін анықтадық, ал STAT1-пен өзара әрекеттесулердің көпшілігі оның CCD, сілтеме домені және ROBO1 С-терминусы арасында жүреді (сурет 4A,E).Екінші жағынан, DI, DIII және OAS3 байланыстырушы аймақтарымен өзара әрекеттесу ROBO1 протеинінің бойына таратылды (Cурет 4A).
Олигоаденилатсинтаза (OAS) ақуыздар тобы жасушаішілік қос тізбекті РНҚ (dsRNA) қабылдайды және байланыстырады, конформациялық өзгерістерге ұшырайды және 2′,5′-байланыстырылған олигоаденилаттарды (2-5 As) 40 синтездейді.Үш OAS арасында OAS3 dsRNA-ға ең жоғары жақындықты көрсететіні және RNase L белсендіретін және осылайша вирустық репликацияны шектейтін 2-5 As ең аз мөлшерін синтездейтіні анықталды.OAS тобы полимеразды бета (пол-β) тәрізді нуклеотидті трансфераза домендерінен тұрады.Алдыңғы зерттеулер C-терминал доменінің (DIII) каталитикалық белсенділігі OAS342 белсендіруі үшін қажет dsRNA-байланыстыратын доменге (DI) тәуелді екенін көрсетті.Біз OAS3 DI және DII домендері CCD және SH2 және STAT1 TAD арасындағы шағын түйісу аймағымен өзара әрекеттесетінін байқадық (4A,F-сурет).Протеин құрылымында әртүрлі айқастырғыш тораптарды қабаттастыру β-парақ пен DBD STAT1 ілмегі мен OAS3 DI доменіндегі 60-75 қалдықтарынан түзілген ашық қалта немесе қуыс арасындағы өзара әрекеттесуді анықтады (Cурет 4G).Кешендегі ақуыздардың бағыты сонымен қатар OAS3-пен өзара әрекеттесулердің ешқайсысы оның DI доменінің ДНҚ-байланыстыру қабілетіне кедергі келтірмейтінін көрсетті (S1A сурет).Сонымен қатар, GTPase MX1 N-терминалды домені OAS3 DI және DIII домендерімен кеңінен әрекеттеседі (4А-сурет).Сондай-ақ, біз OAS1 және MX1 арасындағы өзара әрекеттесуді барлық үш рет өңделді, онда екі MX1 домені (сонымен қатар каталитикалық белсенді) барлық үш MX1 домендерімен өзара әрекеттесуді байқадық (S2A, B).
MX протеиндері GTP-ны байланыстыратын және гидролиздейтін N-терминалды GTPase доменін, өзін-өзі құрастыруға делдалдық жасайтын аралық доменді және GTPase (LZ) қызметін атқаратын C-терминалды лейцин сыдырмасын қамтитын динейн тәрізді GTPазалардың үлкен тобының бөлігі болып табылады. ).домен эффекторлық домен25,43.MX1 вирустық геннің транскрипциясын блоктау үшін вирустық полимеразалардың суббірліктерімен байланысады43.Бұрын хабарланған ашытқы екі гибридті экран PIAS1-байланысты MX1 ДНҚ-байланыстыру белсенділігін блоктау арқылы STAT1-делдалдық ген активациясын тежейтінін және сонымен қатар SUMO E344,45 лигаза белсенділігіне ие екенін көрсетті.Мұнда біз MX1-дің STAT1-мен байланысатынын көрсетеміз (4C,D-сурет), бірақ бұл өзара әрекеттесу IFNα-ға жауап ретінде STAT1-делдалдық геннің белсендірілуіне қалай әсер ететінін қосымша зерттеу қажет.Сонымен қатар, біз MX1 IFNα өңделген барлық үш қайталауда IFIT3 және DDX60-пен өзара әрекеттесетінін анықтадық (S2C сурет).
DDX60 IFN-индукцияланған цитоплазмалық геликаза болып табылады, ол бұрын вирустық RNA46-ның RIG-I-тәуелсіз деградациясында рөл атқаратыны хабарланған.Ол RIG-I-мен өзара әрекеттеседі және оның сигнализациясын лиганд-спецификалық түрде белсендіреді 46. DDX60 DEXD/H-Box геликаза доменінен және вирустық РНҚ мен ДНҚ47-ні байланыстыратын C-терминалды геликаза доменінен тұрады.Оның MX1 және IFIT3-пен өзара әрекеттесуінің көпшілігі канондық домендері немесе мотивтері жоқ ұзақ N- және C-терминал аймақтарында болады (S2E,F-сурет).Дегенмен, MX1 DEXD/H-Box спиральдық доменімен де байланысты (S2E сурет).IFIT отбасының белоктарында тетрапептидтік қайталану (TPR) деп аталатын ерекше бұралмалы спираль мотивінің тандемдік көшірмелері бар.IFIT3 RIG-I сигнализациясының оң модуляторы, демек, MAVS кешенінің құрамдас бөлігі болып табылды.Бірге алғанда, біздің деректеріміз IFIT3 және DDX60 негізінен IFIT3-тің TPR 3-6 арасындағы аймақта өзара әрекеттесетінін және RIG-I/MAVS сигнализациясында рөл атқара алатынын көрсетеді (S2F-сурет).
Бүкіл протеомды тексеруді ескере отырып, интенсивті түрде, содан кейін біз бүкіл адамгершілік дерекқорын IFNα қайталанған қайталанатындардың біреуінің бар екендігі туралы тексердік.Бұл көшірмеде HLA-A үшін бірнеше сенімді өзара әрекеттесу желілерін таптық.MS / MS Spectra анықтаған ақуыз жолдарын талдау MHC-I-Йенсиялық антигенді өңдеу мен презентация интерферонның негізгі жолы болып табылады (Cурет 3D).Сондықтан біз барлық кросс-байланыстырылған үлгілерде жоғары сенімділікпен MHC-I молекулаларының ақуыздық әрекеттесулерін зерттеуге назар аудардық.HLA α1, α2 және α3 домендері мен жеңіл тізбектерден тұрады, ал микроглобулин β2 (β2m) тұрақты шаперон ақуызы болып табылады49.Эндоплазмалық ретикулумда жиналғаннан кейін HLA пептидтік лигандтар болмаған кезде тұрақсыз болады50.Пептидс байланыстыратын ойық жоғары полиморфты және құрылымданған α1 және α2 домендерімен пептидтік емес формадағы және салыстырмалы түрде аз полиморфты α351 доменімен құрылады.IFNα болған жағдайда біз HMA1 және H2B-мен бір рет кездестірдік: HMGA1 және H2B-мен өзара әрекеттесіңіз (5-сурет, S3-сурет), ал екіншісі MDN1, LRCH4 және H2B (6-сурет).
IFNα H2B (H2BFS) және HMGA1-мен HLA-A әрекеттесу желісін индукциялайды.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 кешеніндегі өзара әрекеттесудің әртүрлі түрлерін бейнелейтін 2D сюжеті (SIM-XL бағдарламалық құралында жасалған): өзара байланыс (көк), өзара байланыс (қызыл) және жалғыз сілтеме (қара)..Әртүрлі сәйкестіктердің домендері түсті кодталған32: H2B (гистон; 2–102) және MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 тобы; 210–290 және MHC_I_C; 337–364).Көлденең байланыс шегі 3,5 болып белгіленді.Нүктелік графиктер H2B (B) және HMGA1 (C) бар HLA-A әрекеттесу орындарын, сондай-ақ екі пептидтер арасындағы K немесе S әрекеттесу орындарын көрсетеді.Суретте кросс-байланыс ұпайының шегі 3,0 болып белгіленген.(D) PyMOL бағдарламасындағы H2B, HLA-A және HMGA1 ақуыздарының құрылымдарында көрсетілген ақуыздар арасындағы байланыстар.Бұл құрылымдар PhyRe2 сервері (http://www.sbg.io.ic.ic.ac.uk/phyp.uk/phyre2) және H2B, HLA-A және HMGA1 протеиндерінің шаблон құрылымдары арқылы модельденді, ал HMGA1 ақуыздары 1 кх552, 1Кж349 және 2eeze55 болды.
Ifnα HLA-өзара әрекеттесу желісін H2B (H2BFS), MDN1 және LRCH4 арқылы анықтайды.(A) MDN1 шеңбер түрінде берілген 2D интерактивті картада (SIM-XL бағдарламалық құралында жасалған) ұсынылған молекулаішілік (қызыл) және молекулааралық (көк) көлденең байланыстар.Көлденең байланыс шегі 3,5 болып белгіленді.Әртүрлі сәйкестіктердің домендері түсті кодталған32: H2B (гистон; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 тобы; 210–290 және MHC_I_C; 337–364) және LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) және CH (535–641)).(B) PyMOL бағдарламасындағы H2B, HLA-A, LRCH4 және MDN1 ақуыздарының құрылымдарында көрсетілген ақуыздар арасындағы байланыстар.Бұл құрылымдар PHYRE2 серверін (http://www.sbg.ic.ic.ic.ac.ac.uk/phyRep/phyRep/phyRe2) H2B, 1KJ349, 6HLU62, 6hlu62 және 6I2665, H2B, HLA-A, LRCH4 және MDN1 ақуыздарымен, тиісінше.H2B (C), LRCH4 (D) және MDN1 (E) бар HLA-A үшін K немесе S әрекеттесу орындарын көрсететін нүктелік графиктер.Сюжеттер үшін кросс-байланыс ұпайының шегі 3,0-ге орнатылды.
Гистон H2B геномының тұтастығын сақтаумен қатар транскрипцияны реттеуге де қатысады.H2B протеині ілмектермен бөлінген үш α-спиральдан және С-терминал құйрығынан құралған орталық гистондық доменнен (HFD) тұрады 41,52.H2B-мен өзара әрекеттесудің көп бөлігі HFD гетеродимерімен тримеризацияны қамтамасыз ететін α1 спиральында болады (5А,В-сурет).Лизиндер ДНҚ байланысуына қатысқанымен, кейбір лизиндер балама ацетилдену немесе метилдеу орындары болып табылады.Мысалы, K43, K46, K46 және K57 қалдықтары ДНҚ-ның тікелей байланысуына қатыспайды, бірақ әртүрлі транскрипциядан кейінгі өзгертулердің нысандары 53.Сол сияқты, K44, K47, K47 және K57 қалдықтары басқа ақуыздармен өзара әрекеттесуді қоса алғанда, балама рөл атқара алады.Сонымен қатар, H2B хромосомалық экстрахромосомалық гистон әртүрлі жасуша түрлерінде иммундық жауапты белсендіреді, жұқпалы агенттерден немесе зақымдалған жасушалардан алынған қос тізбекті ДНҚ (dsDNA) фрагменттерін анықтау үшін цитозолдық сенсор ретінде әрекет етеді54.ДНҚ вирустары болған кезде H2B депляциясы IFN-β өндірісін және STAT154 фосфорлануын тежейді.Сондай-ақ, H2B басқа ядролық гистондарға қарағанда ядроның ішіне және одан тезірек қозғалатыны белгілі.MDN1 және LRCH4-пен H2B әрекеттесулері таңдалған өңделмеген үлгілерде де байқалды.Біз HLA-A H2B-мен IFNα өңделген барлық үш үлгіде және өңделмеген бір қайталанатын үлгіде әрекеттесетінін анықтадық.Бұл деректер транскрипциялық реттеуден тәуелсіз балама физиологиялық функциядағы H2B рөлін көрсетеді.
HMGA1 (HOLK жоғары деңгейлі тобы 1), ауруға қарсы аминқышқылдарына бай кішкентай нуклеопротин HLA-A-мен байланысты анықталды.Онда қышқыл С-Терминал құйрығы және үш түрлі DBD бар, өйткені ілмектерде шақырылған, олар DSDNA55,56-да бай аймақтың ұсақ ойығына байлайды.Бұл байланыстыру ДНҚ-ның иілуіне немесе түзетілуіне әкеледі, бұл канондық транскрипция факторларының консенсус тізбегіне қол жеткізуге мүмкіндік береді.C-терминалды құйрығы ақуыз-ақуыздың өзара әрекеттесуіне және транскрипция факторларын жалдауға қатысады, өйткені C-терминалды жою мутанттары транскрипцияны бастай алмайды.Сонымен қатар, бұл доменде бірнеше консервацияланған фосфорлану учаскелері бар, оларда 58 киназалар үшін белгілі субстраттар бар.HLA-A және H2B HMGA1-мен HMGA1-мен өзара әрекеттесуді C-терминалды доменнен тыс жерде бақыладық, бұл C-терминалды домен негізінен транскрипция коэффициентін байланыстыру үшін пайдаланылады деп санаймыз (5А, C).HMGA ақуыздары адаптер ДНҚ-мен байланысу үшін H1 гистонымен бәсекелеседі, осылайша қолжетімділікті арттырады57.Сол сияқты, HMGA гистоны H1-мен бәсекелесе отырып, байланыстырушы ДНҚ бойында H2B гистонымен әрекеттесетін сияқты.HMGB1-e-A ,B және -C-тің және -C-тің Dendritic жасушаларында, олардың белсенділігіне апарады, бірақ HMG және HLA арасындағы өзара әрекеттесу бұрын хабарланған жоқ.Біз HMGA1 HLA-A α1 және α3 домендерімен өзара әрекеттесетінін анықтадық, өзара әрекеттесулердің көпшілігі оның 3 DBD-ден тыс (сурет 5A,C).Біздің қолымызда, HLA-A ядросында локализацияланған (деректер көрсетілмеген), және H2B және HMGA1-де ядрода да, ядрода да бар, бұл ядрода болғандықтан, бұл өзара әрекеттесу.H2B, HLA-A және HMGA1 арасында өлшенетін нақты қондырғылар 5D суретте көрсетілген.
HLA-A-ның басқа ақуыздармен өзара әрекеттесуінің көпшілігі оның α1 және α2 домендерінде және ретсіз С-терминал доменінде болады (6-сурет).Осы мысалдардың бірінде HLA-A LRCH4 ретсіз N-терминал құйрығымен әрекеттесетінін анықтадық (6A,D-сурет).LRCH4 TLR4 активтендіруді және Cytokine Induction, сол арқылы туа біткен иммундық реакцияны модуляциялау60,61.Бұл тоғыз лейцин-бай қайталанатын мембраналық ақуыз (LRRS) және оның эктодомайындағы гомология (CH) гомологиясы, содан кейін 60, 62.CH домендері белок-ақуыз өзара әрекеттесуіне делдал болатыны туралы хабарланды 60 .LRR және CH домендері арасындағы шамамен 300 аминқышқылдарының созылуы салыстырмалы түрде қолжетімді, бірақ ретсіз.Протеин-ақуыз желілері мен везикулярлы көліктің медиаторлары ретінде бұзылған аймақтардың жұмысына сүйене отырып, біз 63-ші ақуыздың көпшілігінде алқаптардың өзара әрекеттесуі бұзылған аймақтарда кездесетінін анықтадық.MDN1-мен өзара әрекеттесулер ақуыздың ұзындығы бойынша, соның ішінде LRR1, LRR6, CH домендері және кездейсоқ аймақтар, ал Х2B негізінен CH доменіне байланысты таратылды (Cурет 6а, b).Атап айтқанда, өзара әрекеттесулердің ешқайсысы CLMS тәсілінің ерекшелігін көрсететін TMJ-ді қамтымайды (6A, B суреті).
MDN1 сонымен қатар HLA-A ақуыз желісінің бөлігі ретінде анықталды (6А-сурет).Ол белоктардың AAA отбасына жатады (әртүрлі әрекеттермен байланысты АТФазалар).Бұл 60S 64 рибосомалық суббірліктен гексамерлік сақинаға ұйымдастырылатын және құрастыру факторын алып тастайтын бірдей N-терминал AAA домені.dynein64,65,66-ға ұқсас болып көрінеді.Сонымен қатар, Asp/Glu бай аймағынан кейін MIDAS домені (металл ионына тәуелді учаске) ​​келеді.MDN1 (шамамен 5600 аминқышқылдары) және оның жақсы зерттелген ақуыздармен гомологияның үлкен көлеміне байланысты, аздап оқытылған ақуыздар, оның құрылымы мен адамдардағы жұмысы туралы аз мәлім.Біз HLA-A, H2B және LRCH4-ті MDN1 байланыстыратын серіктестер ретінде анықтадық және олардың PyMol құрамындағы ақуыз кешендері ретінде бағдарлануын анықтадық (6A,B-сурет).Бұл үш ақуыз AAA доменімен, динин тәрізді байланыстырушы доменмен және MIRAS MDN1 домені бар болуы мүмкін.Алдыңғы есепте жемдік протеиндердің жақындықты тазарту MDN1-ді H2B67 гистонымен байланысты ақуыз ретінде анықтады.Сонымен қатар, жақында зерттеу сонымен қатар MDN және HLA-B арасындағы Affice-тазартылған масс-спектрометрияны қолдана отырып, біздің нәтижелерімізді қолдайтын, Affinity-тазартылған масс-спектрометриямен өзара әрекеттесу туралы хабарлады68.IFNα өңделген үлгілердегі бұл кешеннің идентификациясы интерферон сигналында MDN1 рөлін болжайды.
HLA гендері жоғары полиморфты болғандықтан, біз Flo-1 жасушаларының РНҚ секвенирлеу деректерінен HLA-A, -B және -C салыстыру бойынша секвенирлеуді оқыдық (деректер көрсетілмеген).Секвтеуге сәйкес келетін пептидтік тізбектер HLA-A, -B және -C арасындағы HLA-A (S3-график) орналасқан аймақтарда HLA-A, -B және -C арасындағы едәуір айырмашылықтар анықталды.Сонымен қатар, біз HLA-B/C молекулаларының H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 ақуыздарымен ақуыз-белок кросс-байланысын байқамадық.Бұл HLA-A, MDN1, LRCH1 және HMGA1 арасындағы ақуыздың өзара әрекеттесу HLA-A спецификалық екенін көрсетеді.Сонымен қатар, айқаспаған үлгілердің протеомикалық талдауы (S4-кесте) HLA-B немесе HLA-C салыстырғанда HLA-A жоғары ретті қамтуға ие екенін көрсетті.HLA-A үшін анықталған пептидтер IFNα өңделген және өңделмеген үлгілерде қарқындылығы жоғары болды.
Осы жерде анықталған өзара әрекеттесулер екі ақуызды жақын кеңістіктің жақын орналасуына байланысты емес екендігіне көз жеткізу үшін, біз екі жаңа HLA-ның екі жаңа HLA-мен өзара әрекеттесетін факторларды, ImmunoPrecipation Assists-ті іске асыра отырып, екі жаңа HLA-ді растады.Эндогендік MDN1 және H2B-мен HLA-A өзара әрекеттесуі IFNα өңделген және өңделмеген Flo-1 жасушаларында анықталды (7-сурет, S4 сурет).Біз HLA-A H2B-ді иммунэлектриктерде ұстап алғанын және бұл қауымдастықтың иммундық емделуіне байланысты болғанын растадық, ал бұл қауымдастық иммундық-а иммундық жасушалардан алынған үлгілерде болғандықтан (7А-сурет).Дегенмен, біздің деректеріміз IFNα HLA-A H2B және MDN1 байланысуын дифференциалды түрде реттейтінін көрсетеді.IFNα H2B және HLA-A арасындағы қауымдастықты тудырады, бірақ MDN1-мен бірлестігін төмендетеді.Біз MDN1 Hla-A басқару элементтерімен байланысқан, ал IFNα MDN1 индукциядан тәуелсіз IFNα (7b, C) тәуелсіз осы өзара әрекеттесуді қысқартты.Сонымен қатар, HLA-a иммунопроэтилеуі H2B-ді A549 ұяшығында түсірді (Cурет s4), бұл өзара әрекеттесу ұяшық түріне тәуелсіз екенін білдіреді.Біріктірілген бұл нәтижелер HLA-A-ның H2B және MDN1-мен интерферон арқылы әрекеттесуін қолдайды.
HLA-A H2B және MDN1 бірге тазартады.Өкілдік эндогендік H2B (A) және MDN1 (B) иммуноблоттары IFNα өңделген Flo-1 жасушаларынан иммунопреципитацияланды және көрсетілген антиденелер үшін зерттелді.Теріс бақылау ретінде тышқан мен қоян IgG пайдаланылды.(C) Әртүрлі антигендердің салыстырмалы мөлшерлері (кірістері) көрсетілген антиденелерге қарсы зерттелген иммуноблоттармен бейнеленген, жүктеме бақылауы ретінде β-актин пайдаланылды.
Интерферонмен индукцияланған жоғары сенімді кросс-байланыстырылған желілердің бірінің құрылымдық қасиеттері, H2B-HLA-A-HMGA1 зерттелді.Біз осы кешенге қатысатын ақуыздардың конформациялық динамикасын түсіну үшін балама тәсіл ретінде молекулалық динамикалық модельдеуді қолдандық (8-сурет).CLMS деректерінен алынған қорытындылар H2B, HLA-A және HMGA1 ақуыздарының әртүрлі конформациясының мүмкіндігін болжайды.Сондықтан еріткіш ортада келесі потенциалды комплекстер модельденді: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A және H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада) пакетін пайдаланатын бастапқы ақуыз-белокты қондыру экраны осы ақуыздар арасында ерекшеленетін ықтимал конформацияларды ұсынды (8А-сурет).Қондырғыш протеин кешенін визуализациялау бірнеше өзара әрекеттесулерді және ықтимал конформацияларды анықтады (5А, 8-сурет).Осылайша, бір ықтимал конформация 8А суретінде (белгіленген айқаспалы байланыстармен) көрсетілген және ол MD модельдеу құбырының көмегімен одан әрі бағаланды.Сонымен қатар, H2B немесе HMGA1-дің HLA-A-ға байланысуы H2B-нің HLA-A-ға жоғары жақындығын көрсетеді (8А-сурет).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A және H2B-HLA-A-HMGA1 кешендері арасындағы ықтимал желілердің конформациялық динамикасы.(A) Сол жақ панель - бұл ішкі экволекулярлы (қызыл) және интермолекулярлы (көк) кресло сілтемелерінің 2D картасы (SIM-XL бағдарламалық жасақтамасында жасалған).Сонымен қатар, анықталған кросс-байланыс қалдықтары H2B, HLA-A және HMGA1 ақуыздарының құрылымдарында таңбаланады.Бұл белоктардың сәйкес конформациялары MOE пакетінде енгізілген қондыру құбыры арқылы шығарылды.Төменгі сол жақ панельде H2B-HLA-A және HMGA-HLA және HMGA1-HLA-дің әр түрлі болуы мүмкін, әр түрлі ақуыз-ақуыз байланыстыратын информалар (GBVI / WSA DG; KCAL / MOL).(B) Әрбір ақуыз құрылымы үшін атомдық орындардың (сутегі атомдарын қоспағанда) стандартты ауытқуы (RMSD).(C) Ұзақтығы ≥ 10 нс ерекше әрекеттесулерді ескере отырып, әртүрлі модельденген кешендерден алынған молекула аралық ақуыз-белок сутегі байланысы.h-байланыстың донор-акцепторының кесу қашықтығы 3,5 Å-ге, ал донор-H-акцепторының кесу бұрышы ≥ 160°–180°-қа орнатылды.(D) HLA-A-H2B және HLA-A-HMGA1 жалған кешендерден алынған, ≥ 20 нс құрайтын HLA-A ақуыз-белок өзара әрекеттесуін құрайтын таңбаланған қалдықтар.Белок құрылымдары 100 нс MDS орташа құрылымын білдіреді.(E) HLA-A-H2B және HLA-A-HMGA1 кешендері арасындағы өзара әрекеттесу екі пептидтер арасындағы K немесе S әрекеттесу учаскесіне негізделген 100 нс астам H2B-HLA модельдеуімен бақыланатын өзара әрекеттесулермен салыстырғанда.Кешендер /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Көлденең байланыстарды бағалаудың шекті мәні 3,0 мәніне орнатылды және ≥ 10 ns қабылдайтын MDS-тен ерекше өзара әрекеттесулер ескерілді.Ақуыз құрылымдары BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., Сан-Диего, Калифорния, АҚШ) және Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада) пакеттері арқылы визуалды.
Уақыт өте келе HLA-молекулалардың тұрақтылығы (стандартты ауытқу; RMSD немесе стандартты ауытқу; RMSF) Кешендерде H2B немесе HMGA1 протеиндерінің болуы HLA-A (8b сурет, S5-сурет).HMGA1 протеині HLA-A-ның B2M сайтымен тығыз байланысып, HLA-A-HMGA1 немесе H2B-HLA-A-HMGA1 кешеніндегі HLA-A аминқышқылдарының тұрақтылығын индукциялайды (8В-сурет, S5 сурет).атап айтқанда, HLA қалдықтары ~60-90 және ~180-210 H2B болған кезде аз икемді болып табылды (8В-сурет).H2B және HMGA1 H2B-HLA-A-HMGA1 кешеніндегі HLA-A-мен тек H2B немесе HMGA1-мен байланысуымен салыстырғанда HLA-A-мен жақсы байланысуын көрсетті (8C,D-сурет; S5-кесте).Сутегі байланысына қатысатын қалдықтар (MD моделі бойынша жоғары толтыру ≥ 10 нс) кешендегі CLMS әрекеттесу орындарымен (K немесе S қалдықтары) сәйкес келеді, бұл CLMS арқылы анықталған өзара әрекеттесулердің өте сенімді екенін көрсетеді.Сенімділік (Cурет 8E ).CLMS және MD модельдеуінде шамамен 190-210 және шамамен 200-220 аминқышқылдары арасындағы HLA-A қалдықтары сәйкесінше H2B және HMGA1 байланыстыратыны анықталды (8E-сурет).
Ақуыз-протеиннің өзара әрекеттесуі белгілі бір ынталандыруларға жауап ретінде жасушаішілік байланыс туралы динамикалық құрылымдық желілерді құрайды.Көптеген протеомика ақуыздың жалпы тұрақты деңгейіне өзгерістерді анықтағандықтан, ақуыз-ақуыздың өзара әрекеттесу динамикасы байланыстырушы интерфейстерді алу үшін қосымша құралдарды қажет етеді, ал CLMS осындай құрал болып табылады.Интерферон сигналдық жүйесі жасушаларға қоршаған ортаның патогендік және ішкі патологиялық сигналдарының ауқымына жауап беруге мүмкіндік беретін цитокиндік желі болып табылады, ол интерферон-индукцияланатын ақуыздардың ішкі жиындарының индукциясымен аяқталады.Интерферон индукцияланған ақуыздар панелі арасында жаңа ақуыз-ақуыз әрекеттесулерін анықтауға болатынын анықтау үшін CLMS қолдандық.Протеин кешендерін түсіру үшін интерферонға жауап беретін Flo-1 жасуша үлгісіндегі жаһандық ақуыздың кросс-байланыстыру талдауы пайдаланылды.Триптикалық пептидтерді айқаспаған және көлденең байланысқан жасушалардан алу пептидтерді санауға, жолды байытуға және анықталған LFQ қарқындылығымен пептид ұзындығын бөлуге мүмкіндік береді.Канондық интерферон-индукцияланатын ақуыздар оң ішкі бақылау ретінде анықталды, сонымен бірге MX1, UP18, OAS3 және STAT1 сияқты канондық интерферон-индукцияланатын ақуыздардың жаңа молекулааралық және молекулаішілік айқаспалы қосындылары байқалды.Функционалдық салалардағы әртүрлі құрылымдық ерекшеліктер мен өзара әрекеттесулер зерттелді.
HLA-A, MDN1 және H2B арасындағы өзара әрекеттесу IFNα-мен өңделген және өңделмеген Flo-1 және A549 жасушаларында иммуноблоттау арқылы анықталды.Нәтижелеріміз HLA-A H2B-мен IFNα-тәуелді түрде қосылатынын көрсетеді.Біздің жұмысымыз осы екі кешеннің бірлескен локализациясын одан әрі зерттеудің қызықты жолын көрсетеді.Сондай-ақ, жасуша типіндегі интерферонмен араласқан ақуыздың өзара әрекеттесуін анықтау үшін жасуша желілеріне кіруді кеңейту қызықты болар еді.Соңында, біз MD модельдеуін қолдандық, ол H2BFS-HLA-A-HMGA1 кешеніне қатысқан протеиндердің конформация динамикасын түсіну үшін қолданды, ол ішкі және аралас кросс-келіссөздер жүргізеді.CLMS деректерінен тұжырымдар H2BFS, HLA-A және HMGA1 ақуыздарының әртүрлі болуы мүмкіндігін ұсынады.Осы қондыру ақуыз кешендері арасындағы ықтимал әртүрлі конформациялар CLMS деректер жинағында байқалғанға ұқсас бірнеше өзара әрекеттесулерді анықтады.Әдісіміздің басты күшті жақтарының бірі - ол HLA сияқты өзара әрекеттесетін жоғары полиморфты гендерді оңай анықтауға мүмкіндік береді, сондықтан зерттеуге қиын болатын HLA гаплотипіне тән белоктардың өзара әрекеттесуін зерттеу қызықты болады.Бірге алғанда, біздің деректеріміз CLMS-ті интерферонмен индукцияланған сигналдық желілер туралы түсінігімізді кеңейту және ісік микроортасында неғұрлым күрделі жасушааралық жүйелерді зерттеуге негіз болуы үшін пайдалануға болатындығын көрсетеді.
Flo-1 жасушалары ATCC-ден алынды және 1% пенициллин/стрептомицин (Invitrogen), 10% ұрықтың ірі қара сарысуы (Gibco) қосылған DMEM (Gibco) ішінде ұсталды және 37°C және 5% CO2 температурасында сақталды.Инкубация.Жасушалар IFNα14 (Эдинбург протеин өндіру зауытында өндірілген) өңделгенге дейін 70-80% қосылуға дейін өсірілді.Барлық басқа химиялық заттар мен реагенттер, егер басқаша көрсетілмесе, Sigma Aldrich компаниясынан сатып алынған.
6 ұңғыма табақшаларында және келесі күні FLO-1 жасушалары өңірілді, ал келесі күні жасушаларда 10 сағат ішінде 10 сағатқа дейін қарады.Жасушалар PBS-пен үш рет жуылды және 0,5 мМ соңғы концентрацияға дейін 37°C температурада 5 минут бойы PBS-те жаңадан дайындалған DSS (Thermo Fisher Scientific) (DMSO-да ерітілген) байланыстырылды.DSS қиылысқан реакциясы PBS-пен ауыстырылды, ал қалдық DSS-пен, ал қалдық DSS-ке дейін (рН 8,0) 15 минут, 37 ° C температурада.Жасушаларды қырып алу және төмен байланыстыратын түтіктерге (Оттегі) жинады.
Жасуша түйіршіктері 300 мкл мочевина лизис буферімен (8 М мочевина, 0,1 М Tris, рН 8,5) 30 минут бойы бөлме температурасында мезгіл-мезгіл шайқау арқылы лизиске ұшырады.Барлық центрифугалау қадамдары 8 ° C температурада 14000 xg-да жүргізілді.Lysyate-ді 10 минут бойы центрифуганы және супернатанды жаңа түтікке өткізіңіз.Қалған мөлдір бөлшектер 150 мкл екінші лизис буферінде (2 М мочевина, 2% (салм/көлем) SDS (натрий додецил сульфаты)) біртекті сулы ерітінді алынғанша 30 минут немесе одан да көп ерітілді.Лизат 20 минут бойы центрифугульзерленген, сондықтан супернатант алдыңғы қадамда алынған лизатпен араластырылды.Ақуыздың концентрациясы Micro BCA Comsay (термо фишер ғылыми), өндірушінің микроклесс процедуралары бойынша нұсқаулық бойынша бағаланды.Үлгілер сұйық азотта тез мұздатылған және -80°C температурада сақталған.
Шамамен 100 мкг еритін кросс-байланыстырылған протеин Wisniewski және т.б. сипаттағандай модификацияланған фильтрация үлгісін дайындау протоколы (FASP) арқылы өңделді.69 Қысқаша айтқанда, ақуыз 200 мкл мочевина буферімен (8 М мочевина 0,1 M Tris, рН 8,5) айқастырып, құйынды және екі есе азайтады.Барлық центрифугалау қадамдары 25°C температурада 14000 xg орындалды.Кросс-байланыстырылған ақуыз лизатының бірінші жартысы Ultracel-10 мембранасымен (Merck) жабдықталған 10 кДа Microcon центрифугалық сүзгі құрылғысына ауыстырылды, содан кейін сүзгіде 25 минут бойы центрифугалау жүргізілді.Содан кейін ақуыздың екінші жартысын сүзгіге қосып, сол әрекеттерді қайталаңыз.Ақуызды қалпына келтіру мочевина буферіне 100 мкл 17 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлоридін (TCEP) қосу арқылы орындалды.Қалпына келтіру термомиксерде 600 айн/мин 37°C температурада 30 минут бойы араластырылды.Сонымен қатар, баған центрифугадан өтті және мочевина буферіндегі 100 мкл 50 мМ йодоацетамид арқылы тотықсызданған кросс-байланыстырылған ақуыз алкилирленді.Алкилдену реакциясы бөлме температурасында 20 минут қараңғы жерде жүргізілді.Колонканы айналдырыңыз, колонна қабырғаларын 100 мкл мочевина буферімен 3 рет жуыңыз, содан кейін центрифугалаңыз.Дәл осындай операция 100 мкл 100 мм аммоний бикарбонатын пайдаланып 3 рет орындалды.Трипсинация алдында жинау түтігін жаңасымен ауыстырыңыз.Құрамында 50 мМ аммоний бикарбонаты және трипсин буферінде (Promega) сұйылтылған 1 мкл трипсин бар ас қорыту буферін қосыңыз.Трипсиннің протеинге қатынасы шамамен 1:33 деңгейінде сақталды, ал ас қорыту реакциялары түні бойы 37°C температурада ылғалды камерада инкубацияланды.Айқас байланысқан пептид 25 минут бойы центрифугалау арқылы сүзгіден шығарылды.Пептидтерді қалпына келтіру сүзгіге 50 мкл 0,5 М NaCl қосу, содан кейін 25 минут бойы центрифугалау арқылы жақсарды.
C18 Micro Spin бағандары (Гарвард аппараты) кішігірім модификациялармен Bouchal және т.б.70 сипаттаған хаттамаға сәйкес кросс-байланыстырылған триптикалық пептидтерді тұзсыздандыру үшін пайдаланылды.Қысқаша айтқанда, C18 айналдыру бағандары ацетонитрилдегі (AcN) (Merck) 0,1% құмырсқа қышқылының (FA) үш жууымен және 0,1% FA екі рет жууымен белсендірілді.Колонна 0,1% FA 15 минут бойы гидратацияланды.Үлгілерді айналдыру бағандарына салыңыз және 3 рет 0,1% FA-мен жуыңыз.Тұзсыздандырылған пептидтер 0,1% FA құрамындағы 50%, 80% және 100% AcN көмегімен сатылы градиентпен дәйекті түрде элюцияланды.Үлгілер SpeedVac Plus концентраторында (Эппендорф) қалдық сұйықтық толығымен жойылғанша кептірілді.Элюцияланған пептидтер 100 мкл 0,08% трифторсірке қышқылында 2,5% AcN құрамында ерітілді және концентрациялар NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) құрылғысында өлшенді.Бір үлгіге шамамен 1 мкг айқаспалы пептид LC-MS/MS жүйесіне енгізілді.
Айқас байланысқан пептидтер Orbitrap Exploris 480 масс-спектрометріне (Thermo Scientific) қосылған UltiMate 3000 RSLCnano LC жүйесінде (Thermo Scientific) бөлінді.Айқас байланысқан пептидтер C18 PepMap100 сорбенті және 5 мкм PepMap сорбенті (Thermo Scientific) салынған 300 мкм ID, 5 мм ұзындықтағы μ-бағанға дейінгі C18 түсіру бағанында жиналды.Сорғының ағынын 5 мкл / мин 0,08% -ға салыңыз, бұл 2,5% мөлшерде еріген.Көлденең пептидтер аналитикалық тұндырылған кремний бағанында, ішкі диаметрі 75 мкм және ұзындығы 150 мм, ұзындығы 150 мм, ұзындығы 150 мм, ал 2 мкм пепап сорғышпен (термо) толтырылған.А және В жылжымалы фазалары сәйкесінше судағы 0,1% FA және ацетонитрилдегі 0,1% FA-дан тұрды.Градиент 2,5% B-ден басталады және 90 минут ішінде 40% B-ге, содан кейін келесі 2 минут ішінде 90% B-ге дейін сызықты түрде артады.Жылжымалы фаза құрамы 10 минут бойы 90% B деңгейінде сақталды, содан кейін 2 минут ішінде 2,5% B дейін сызықты түрде төмендеді.Баған келесі циклге дейін 8 минут бойы 2,5% B деңгейінде теңестірілді.Аналитикалық бағаннан алынған кросс-пептидтер аналитикалық бағаннан иондалған, NanoElectroSprosprySpray (NSI) көздерінде (NSI), Exploris 480 масс-спектрометріне (термо) енгізілді.
Orbitrap Exploris 480 масс-спектрометрі оң деректер корреляциясы режимінде жұмыс істеді.Толық сканерлеу m/z 350 Th-ден m/z 2000 Th-ге дейінгі диапазон параметрлерімен 120 000 ажыратымдылықта бөлім режимінде орындалды.Қалыпты AGC мақсаты 50 мс ең көп енгізу уақытымен 300% деңгейінде орнатылды.Пептидтер үшін моноизотоптық шыңдарды анықтау орнатылды.Тым аз прекурсорлар табылса, шектеу релаксация параметрі шын мәніне орнатылады.Прекурсордың минималды иондық күші 5,0e3-ке орнатылды және +8-ге дейінгі прекурсор зарядының күйлері эксперименттерге қосылды.
Деректер корреляция режиміндегі негізгі сканерлеулер арасындағы цикл уақыты 2,5 секундқа орнатылды.Динамикалық массаны алып тастау прекурсор ионының бірінші фрагментациясынан кейін 20 секундқа орнатылды.Прекурсорды оқшаулау терезесі 2 мыңға орнатылды.Белгіленген соқтығыс энергиясының режимі бар нормаланған соқтығыс энергиясының түрі деректерге тәуелді MS/MS сканерлеуінде таңдалды.Соқтығыс энергиясы 30%-ға орнатылды.Orbitrap рұқсаты 15 000 және AGC мақсаты 100% деп белгіленді.Таңдамалы максималды енгізу уақыты 60 миллисекундқа орнатылған.
Кросс-байланыстырылған үлгілердегі ақуыз-белок желісін қадағалау алдында біз үлгілердегі қадағаланатын пептидтерді/белоктарды анықтау үшін MaxQuant бумасын (1.6.12.0 нұсқасы)26,27 пайдаланып өңделмеген файлдарды өңдедік.Сонымен қатар, ұқсас протеомдық талдаулар IFNα-мен өңделген және өңделмеген тоғыспаған Flo-1 үлгілерінде орындалды.MS/MS деректері UniProt адам дерекқорында (www.uniprot.org) (2020 жылдың 12 тамызында жүктелген, 75 093 жазбадан тұрады) Andromeda27 кірістірілген іздеу жүйесі арқылы ізделді.Іздеу ферменттің ерекшелігін көрсетпей және деамидтену (N, Q) және тотығу (M) әртүрлі модификацияларынсыз жүргізілді.Прекурсорлардың массалық төзімділіктері 20 ppm және өнім иондары 0,02 Да-ға орнатылды.Бастапқы және максималды массалық ауытқу 10 ppm деп белгіленді.Пептидтің максималды массасы 4600 Да белгіленді және реттілік ұқсастығы 7 және 25 аминқышқылдары (аа) арасында орнатылды.Әрі қарай статистикалық талдау Perseus бағдарламасының көмегімен жүргізілді (1.6.10.45 нұсқасы).Протеин мазмұны ақуыздың спектрлік қарқындылығын қалыпқа келтіру арқылы есептелді (LFQ қарқындылығы; белгіленбеген сандық көрсеткіш)27 және қарқындылық мәндері Log2-ге түрлендірілді.Олардың пептидтік қарқындылығымен анықталған ақуыздардың иерархиялық кластері R (v 4.1.2) ішіндегі феатмап (v1.0.12) бумасын пайдалану арқылы құрастырылды.Жолды байыту талдауы өңделмеген үлгілермен салыстырғанда төрт еседен астам белсендірілген IFNα өңделген ақуыздар үшін Reactome жолының дерекқорын пайдалану арқылы орындалды.
LC-MS/MS арқылы бақыланатын белок кешендерінің лизин (K) немесе сериндік (S) спецификалық химиялық кросс-байланыстарын сәйкестендіру кросс-байланыстырылған пептидтерге (SIM-XL)29 спектроскопиялық сәйкестендіру машинасының (SIM-XL) көмегімен орындалды.Біріншіден, интерферонмен байланысты (IFN) ДНҚ-ның зақымдануының кедергісі (IRDS) гендері арасындағы өзара әрекеттесулер PARARIYA және AL.28-де сипатталған IRD Partein DataSet арқылы зерттелді.Экранды скрининг және бүкіл адамгершіліктің барлық жағдайлары және қайталанған адамдар, сондықтан бүкіл адамгершілік дерекқоры (www.uniprot.org) (www.uniprot.org) (12 тамыз 2020, 12 тамызда жүктелді, 7,5093 жүктеледі, 75,093, 75,093).Жоғары сенімді өзара әрекеттесуге арналған сүзгілердің бірі.Алынған бұл жоғары мәнді өзара әрекеттесулер кеңейтілді және барлық қайталаулар мен жағдайларда сынақтан өтті.
SIM-XL жүйесінде DSS кросслинкер (XL) үшін пайдаланылды және XL салмағының ауысуы мен модификация салмағының ауысуы тиісінше 138,06 және 156,07 мәніне орнатылды.Келесі айқаспалы байланыс реакция орындары қарастырылады: KK, KS және KN-TERM, репортер иондары жоқ.Прекурсордың да, фрагменттің де ppm мәні 20-ға орнатылды және Xrea шегі 0,15-ке орнатылды.Трипсин толық спецификалық болып саналды және жоғары энергиялық C-тұзақ (HCD) фрагментация әдісі жүзеге асырылды.XCorr динамикалық ДҚ қысқарту шегі және динамикалық МҚ азайту үшін пептидтердің ең аз саны тиісінше 2,5 және 2 болып орнатылды.Басқа параметрлер: моноизотоптың ықтималдылығы және ең жоғары сәйкестіктің кесіндісі, бір жіпке ең аз 4 АА қалдығы және ең көп заряд заряды және өткізіп алған бөлінулердің 3 максимумы.Алынған тігілген 2D карталары (SIM-XL) талданды және 2D карталарын құру үшін xQuest28 графикалық көрінісі пайдаланылды.Ақуыз құрылымдарындағы протеиннің қиылысуы PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, Schrödinger, LLC нұсқасы 2.0) ішінде берілген.
Ақуыз моделінің құрылымдары Phyre2 серверінің (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 көмегімен гомологиялық модельдеу және «Жасырын Марков әдісін» жүзеге асыру принциптерін пайдалана отырып жасалды.Phyre2 белгілі ақуыз құрылымдарымен реттілікке негізделген үлгі құрылымдарын жасайды.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 және MDN1 ақуыздары үшін 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 және 6i2665 үлгі құрылымдары пайдаланылды.Сонымен қатар, AlphaFold71 MX1, UBP18 және ROBO1 құрылымы да қарастырылды.Ақуыз құрылымы BIOVIA Discovery Studio Visualizer бумасы (Dassault Systèmes, BIOVIA, Сан-Диего, CA, АҚШ) және Molecular Operating Environment пакеті (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада) арқылы визуалды.