Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Әр слайдта үш мақаланы көрсететін слайдерлер.Слайдтар арқылы жылжу үшін артқа және келесі түймелерді немесе әр слайд бойынша жылжу үшін соңында слайд контроллері түймелерін пайдаланыңыз.

317 Тот баспайтын болаттан жасалған түтіктерді жеткізушілер

Тот баспайтын болаттан жасалған материалдың химиялық құрамы кестесі

SPACA6 - сүтқоректілердің жыныстық көбеюі кезінде гамета синтезі үшін маңызды болып табылатын сперматозоидпен экспрессияланған беткі ақуыз.Осы іргелі рөлге қарамастан, SPACA6 спецификалық функциясы нашар түсініледі.Біз SPACA6 жасушадан тыс доменінің кристалдық құрылымын 2,2 Å рұқсатында анықтаймыз, төрт тізбекті байламнан және квази икемді байланыстырғыштармен қосылған Ig тәрізді β-сэндвичтерден тұратын екі доменді ақуызды анықтаймыз.Бұл құрылым IZUMO1-ге ұқсайды, гамета синтезімен байланысты басқа ақуыз, SPACA6 және IZUMO1-ді осы құжатта IST суперотбасы деп аталатын ұрықтандырумен байланысты белоктардың супертүрінің негізін қалаушы мүшелері етеді.IST суперотбасы құрылымдық түрде оның бұралған төрт спиральді байламы және дисульфидпен байланысқан CXXC мотивтерінің жұбымен анықталады.Адам протеомының құрылымына негізделген AlphaFold іздеуі осы суперфамилияның қосымша ақуыз мүшелерін анықтады;Атап айтқанда, бұл ақуыздардың көпшілігі гамета синтезіне қатысады.SPACA6 құрылымы және оның IST суперфамилиясының басқа мүшелерімен қарым-қатынасы сүтқоректілердің гаметалар синтезі туралы біліміміздегі жетіспейтін сілтемені қамтамасыз етеді.
Әрбір адамның өмірі екі бөлек гаплоидты гаметадан басталады: әкесінің ұрығы мен ананың жұмыртқасы.Бұл сперматозоид интенсивті іріктеу процесінің жеңімпазы болып табылады, оның барысында миллиондаған сперматозоидтар әйел жыныс жолдары арқылы өтіп, әртүрлі кедергілерді жеңіп1 және олардың қозғалғыштығын және беткі компоненттердің2,3,4 процесін күшейтетін сыйымдылықтан өтеді.Шәует пен аналық жасуша бір-бірін тапса да, процесс әлі аяқталмаған.Ооцит кумулус жасушаларының қабатымен және zona pellucida деп аталатын гликопротеидті тосқауылмен қоршалған, ол арқылы сперматозоид жұмыртқаға өтуі керек.Сперматозоидтар осы соңғы кедергілерді жеңу үшін беттік адгезия молекулалары мен мембранамен байланысты және секрецияланған ферменттердің комбинациясын пайдаланады5.Бұл молекулалар мен ферменттер негізінен ішкі мембранада және акросомалық матрицада сақталады және акросомалық реакция кезінде сперматозоидтың сыртқы қабығы ыдырағанда анықталады6.Бұл қарқынды саяхаттың соңғы кезеңі екі жасуша мембраналарын біріктіріп, бір диплоидты организмге айналатын сперматозоид-жұмыртқа синтезі болып табылады7.Бұл процесс адамның көбеюіндегі жаңашыл болғанымен, қажетті молекулалық өзара әрекеттесулер аз зерттелген.
Гаметалардың ұрықтануынан басқа, екі липидті қос қабаттың қосылуының химиясы жан-жақты зерттелді.Жалпы алғанда, мембрана синтезі - бұл екі мембрананы бір-біріне жақындататын, олардың үздіксіздігін бұзатын және синтезді тудыратын құрылымдық конформациялық өзгеріске ұшырау үшін ақуыз катализаторын қажет ететін энергетикалық қолайсыз процесс8,9.Бұл ақуыз катализаторлары фузогендер ретінде белгілі және сансыз синтез жүйелерінде табылған.Олар вирустың хост жасушаларына енуі үшін қажет (мысалы, АИВ-1-де gp160, коронавирустарда спике, тұмау вирустарында гемагглютинин)10,11,12 плацентарлы (синцитин)13,14,15 және төменгі эукариоттарда гамета түзетін синтездер ( Өсімдіктерде, протистерде және буынаяқтыларда HAP2/GCS1) 16,17,18,19.Адам гаметаларына арналған фузогендер әлі ашылған жоқ, дегенмен бірнеше ақуыздар гаметалардың қосылуы мен синтезі үшін маңызды болып табылады.Ооцитпен экспрессияланған CD9, тышқан мен адам гаметаларының қосылуы үшін қажет трансмембраналық ақуыз, бірінші болып ашылды 21,22,23.Оның нақты функциясы түсініксіз болып қала берсе де, адгезиядағы рөлі, жұмыртқа микробүрсілеріндегі адгезия ошақтарының құрылымы және/немесе ооцит бетіндегі ақуыздардың дұрыс локализациясы 24,25,26 болып көрінеді.Гаметаларды біріктіру үшін маңызды болып табылатын ең типтік екі ақуыз IZUMO127 сперматозоид және JUNO28 ооцит ақуызы болып табылады және олардың өзара байланысы гаметаларды тану және біріктіру алдында адгезияда маңызды қадам болып табылады.Еркек Izumo1 нокаут тышқандары мен Джуно нокаут тышқандары толығымен стерильді, бұл модельдерде сперматозоидтар перивителлиндік кеңістікке енеді, бірақ гаметалар біріктірілмейді.Адамның in vitro ұрықтандыру эксперименттерінде гаметалар анти-IZUMO1 немесе JUNO27,29 антиденелерімен өңделген кезде ұқсастық азайды.
Жақында IZUMO1 және JUNO20,30,31,32,33,34,35 фенотипіне ұқсас шәуетпен экспрессияланған ақуыздардың жаңадан ашылған тобы ашылды.Шәует акросомалық мембранамен байланысқан ақуыз 6 (SPACA6) кең ауқымды тышқан мутагенезін зерттеуде ұрықтандыру үшін маңызды болып анықталды.Трансгенді Spaca6 геніне енгізу ерімейтін сперматозоидтарды тудырады, дегенмен бұл сперматозоидтар перивителлиндік кеңістікке 36 инфильтрацияланады.Тышқандардағы кейінгі нокаут зерттеулері Spaca6 гамета синтезі үшін қажет екенін растады 30,32.SPACA6 тек қана аталық бездерде көрінеді және IZUMO1-ге ұқсас локализация үлгісіне ие, атап айтқанда акросомалық реакцияға дейін сперматозоидтардың интимасында, содан кейін акросомалық реакциядан кейін экваторлық аймаққа ауысады 30,32.Spaca6 гомологтары әртүрлі сүтқоректілерде және басқа эукариоттарда 30 бар және оның адам гаметасын біріктіру үшін маңыздылығы SPACA6 30 төзімділігі арқылы адамның in vitro ұрықтандыруын тежеу ​​арқылы көрсетілді.IZUMO1 және JUNO-дан айырмашылығы, SPACA6 құрылымының, өзара әрекеттесуінің және функциясының егжей-тегжейлері анық емес.
Адам ұрығы мен жұмыртқасының қосылуының негізінде жатқан іргелі процесті жақсырақ түсіну үшін, отбасын жоспарлау мен ұрпақты болуды емдеудегі болашақ оқиғаларды хабардар етуге мүмкіндік береді, біз SPACA6 құрылымдық және биохимиялық зерттеулерін жүргіздік.SPACA6 жасушадан тыс доменінің кристалдық құрылымы квази-икемді аймақтармен байланысқан төрт спиральді байлам (4HB) және иммуноглобулин тәрізді (Ig тәрізді) доменді көрсетеді.Алдыңғы зерттеулерде болжанғандай, 7,32,37 SPACA6 доменінің құрылымы адамның IZUMO1 құрылымына ұқсас және екі ақуыз ерекше мотивпен бөліседі: үшбұрышты спираль беті бар 4HB және дисульфидпен байланысқан CXXC мотивтерінің жұбы.Біз IZUMO1 және SPACA6 енді гамета синтезімен байланысты белоктардың үлкенірек, құрылымдық байланысты суперфамилиясын анықтауды ұсынамыз.Жоғары отбасына ғана тән мүмкіндіктерді пайдалана отырып, біз AlphaFold құрылымдық адам протеомын толық іздестірдік, осы суперотбасының қосымша мүшелерін, соның ішінде гамета синтезіне және/немесе ұрықтандыруға қатысатын бірнеше мүшені анықтадық.Енді гамета синтезімен байланысты ақуыздардың жалпы құрылымдық қатпары және суперфамилиясы бар сияқты және біздің құрылым адам гаметасының қосылу механизмінің осы маңызды аспектінің молекулалық картасын береді.
SPACA6 – бір N-байланыстырылған гликаны және алты болжамды дисульфидтік байланысы бар бір өтуі бар трансмембраналық ақуыз (S1a және S2 суреттері).Біз Drosophila S2 жасушаларында адамның SPACA6 (қалдық 27-246) жасушадан тыс доменін экспрессияладық және никельдің жақындығы, катион алмасуы және өлшемді алып тастау хроматографиясы арқылы ақуызды тазарттық (S1b-сурет).Тазартылған SPACA6 эктодомені өте тұрақты және біртекті.Көпбұрышты жарық шашырауымен (SEC-MALS) біріктірілген өлшемді алып тастау хроматографиясын қолданатын талдау 26,2 ± 0,5 кДа есептелген молекулалық салмағы бар бір шыңды көрсетті (S1c сурет).Бұл SPACA6 мономерлі эктодомен өлшеміне сәйкес келеді, бұл тазарту кезінде олигомеризация болмағанын көрсетеді.Сонымен қатар, дөңгелек дихроизм (CD) спектроскопиясы балқу температурасы 51,3 °C болатын аралас α/β құрылымын анықтады (S1d,e-сурет).CD спектрлерінің деконволюциясы 38,6% α-спиральді және 15,8% β-тізбекті элементтерді анықтады (S1d сурет).
SPACA6 эктодомені кездейсоқ матрицалық себу38 көмегімен кристалданды, нәтижесінде 2,2 Å ажыратымдылығы бар деректер жинағы алынды (1-кесте және S3 сурет).Құрылымды анықтау үшін фрагментке негізделген молекулалық алмастыру және SAD фазалық деректерінің бромид экспозициясы бар комбинациясын пайдалана отырып (1-кесте және S4 сурет), соңғы тазартылған модель 27-246 қалдықтарынан тұрады.Құрылым анықталған кезде эксперименттік немесе AlphaFold құрылымдары қол жетімді болмады.SPACA6 эктодоменінің өлшемі 20 Å × 20 Å × 85 Å, жеті спиральдан және тоғыз β-жіптен тұрады және алты дисульфидтік байланыспен тұрақтандырылған ұзартылған үшінші реттік қатпары бар (1а, б-сурет).Asn243 бүйірлік тізбегінің соңындағы әлсіз электрон тығыздығы бұл қалдық N-байланысты гликозилдену екенін көрсетеді.Құрылым екі доменнен тұрады: N-терминалды төрт спиральды байлам (4HB) және олардың арасында аралық топса аймағы бар C-терминал Ig тәрізді домен (1c-сурет).
a SPACA6 жасушадан тыс доменінің құрылымы.SPACA6 жасушадан тыс доменінің жолақ диаграммасы, N-тен C-терминусына дейінгі тізбектің түсі қою көктен қою қызылға дейін.Дисульфидті байланыстарға қатысатын цистеиндер қызыл қызыл түспен ерекшеленген.b SPACA6 жасушадан тыс доменінің топологиясы.1а-суреттегідей түс схемасын пайдаланыңыз.c SPACA6 жасушадан тыс домен.4HB, топса және Ig тәрізді домендік жолақ диаграммалары сәйкесінше қызғылт сары, жасыл және көк түсті.Қабаттар масштабтау үшін тартылмайды.
SPACA6 4HB доменіне төрт негізгі спираль (1–4 спираль) кіреді, олар спираль тәрізді спираль түрінде орналасқан (2а-сурет), параллельге қарсы және параллель әрекеттесулер арасында ауысады (2б-сурет).Шағын қосымша бір айналымды спираль (спирал 1′) шоғырға перпендикуляр төселіп, 1 және 2 спиральдары бар үшбұрышты құрайды. Бұл үшбұрыш 3 және 4 (спираль) салыстырмалы тығыз орамасының бұрандалы бұралған орауында аздап деформацияланған. 2а-сурет).
4HB N-терминалының жолақ диаграммасы.b Төрт спираль шоғырының жоғарғы көрінісі, әрбір спираль N ұшында қою көк түспен және C ұшында қою қызыл түспен бөлектелген.c 4HB үшін жоғарыдан төмен қарай спиральды дөңгелек диаграммасы, әрбір қалдық бір әріпті амин қышқылы коды бар шеңбер түрінде көрсетілген;дөңгелектің жоғарғы жағындағы төрт аминқышқылдары ғана нөмірленген.Полярлы емес қалдықтар сары түске, полярлық зарядсыз қалдық жасыл түске, оң зарядты қалдық көк түске, теріс зарядталған қалдықтар қызыл түске боялады.d 4HB доменінің үшбұрышты беттері, 4HBs қызғылт сары және топсалары жасыл.Екеуі де таяқша тәрізді дисульфидті байланыстарды көрсетеді.
4HB негізінен алифатты және хош иісті қалдықтардан тұратын ішкі гидрофобты өзекке шоғырланған (Cурет 2c).Өзекте Cys41 және Cys55 арасындағы дисульфидтік байланыс бар, ол 1 және 2 спиральдарды жоғарғы көтерілген үшбұрышта біріктіреді (2d-сурет).Helix 1′ ішіндегі CXXC мотиві мен топса аймағындағы β-шаш түйреуіштің ұшында табылған басқа CXXC мотиві арасында қосымша екі дисульфидті байланыс түзілді (2d-сурет).Белгісіз функциясы бар консервативті аргинин қалдығы (Arg37) 1′, 1 және 2 спиральдардан құралған қуыс үшбұрыштың ішінде орналасқан. Cβ, Cγ және Cδ Arg37 алифаттық көміртегі атомдары гидрофобты ядромен әрекеттеседі және оның гуанидин топтары циклді түрде қозғалады. Thr32 магистральдық және бүйірлік тізбек арасындағы өзара әрекеттесу арқылы 1′ және 1 спиральдар арасында (S5a,b-сурет).Tyr34 қуысқа еніп, Arg37 еріткішпен әрекеттесе алатын екі шағын қуыстарды қалдырады.
Ig-тәрізді β-сэндвич домендері – гидрофобты өзек арқылы өзара әрекеттесетін екі немесе одан да көп көп тізбекті амфипатикалық β-парақтардың ортақ қасиетін бөлісетін белоктардың үлкен топтамасы. және екі қабаттан тұрады (S6a-сурет).1-парақ төрт жіптен (D, F, H және I жіптерден) тұратын β-парақ болып табылады, онда F, H және I жіптері параллельге қарсы орналасуды құрайды, ал I және D жіптері параллель әсерлеседі.2-кесте шағын антипараллельді қос тізбекті бета парағы (Е және G жіптері).Е тізбегінің С-соңы мен Н тізбегінің ортасы (Cys170-Cys226) арасында ішкі дисульфидті байланыс байқалды (S6b-сурет).Бұл дисульфидтік байланыс иммуноглобулиннің β-сэндвичтік доменіндегі дисульфидтік байланысқа ұқсас40,41.
Төрт жіпті β-парақ пішіні мен электростатикасы бойынша ерекшеленетін асимметриялық жиектерді құра отырып, бүкіл ұзындығы бойынша бұрылады.Жіңішке жиегі - SPACA6-дағы қалған біркелкі емес және электростатикалық әртүрлі беттермен салыстырғанда ерекшеленетін тегіс гидрофобты орта беті (S6b,c-сурет).Ашық магистральдық карбонил/амин топтары мен полярлы бүйірлік тізбектердің ореолы гидрофобты бетті қоршайды (S6c-сурет).Кеңірек жиегі гидрофобты ядроның N-терминалды бөлігін блоктайтын және F тізбегінің магистральды ашық полярлық тобымен үш сутектік байланыс түзетін қақпақпен жабылған бұрандалы сегментпен жабылған (S6d сурет).Бұл жиектің C-терминал бөлігі жартылай ашық гидрофобты өзегі бар үлкен қалтаны құрайды.Қалта екі қос аргинин қалдықтарының (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 және Arg212-Arg214) және орталық гистидиннің (His220) арқасында оң зарядтармен қоршалған (S6e сурет).
Топса аймағы бір антипараллельді үш тізбекті β-қабаттан (A, B және C жіптері), шағын 310 спиральдан және бірнеше ұзын кездейсоқ бұрандалы сегменттерден тұратын бұрандалы домен мен Ig тәрізді домен арасындағы қысқа сегмент.(S7-сурет).Топса аймағындағы ковалентті және электростатикалық контактілер желісі 4HB және Ig тәрізді домен арасындағы бағдарды тұрақтандыратын сияқты.Желіні үш бөлікке бөлуге болады.Бірінші бөлік топсадағы β-шаш түйреуіш пен 4HB-дегі 1′ спираль арасында жұп дисульфидті байланыстарды құрайтын екі CXXC мотивін (27CXXC30 және 139CXXC142) қамтиды.Екінші бөлік Ig тәрізді домен мен топса арасындағы электростатикалық әсерлесуді қамтиды.Топсадағы Glu132 Ig тәрізді домендегі Arg233 және топсадағы Arg135 бар тұз көпірін құрайды.Үшінші бөлік Ig тәрізді домен мен топса аймағы арасындағы коваленттік байланысты қамтиды.Екі дисульфидті байланыс (Cys124-Cys147 және Cys128-Cys153) топса ілмегін Gln131 және магистральдық функционалдық топ арасындағы электростатикалық өзара әрекеттесу арқылы тұрақтандырылған байланыстырғышқа қосады, бірінші Ig тәрізді доменге қол жеткізуге мүмкіндік береді.шынжыр.
SPACA6 эктодоменінің құрылымы және 4HB және Ig-тәрізді домендердің жеке құрылымдары ақуыз дерекқорларындағы құрылымдық ұқсас жазбаларды іздеу үшін пайдаланылды 42 .Біз Dali Z жоғары ұпайлары, шағын стандартты ауытқулары және үлкен LALI ұпайлары бар сәйкестіктерді анықтадық (соңғысы құрылымдық эквивалентті қалдықтардың саны).Толық эктодоменді іздеудегі алғашқы 10 хиттің (S1 кестесі) қолайлы Z-балы >842 болғанымен, тек 4HB немесе Ig тәрізді доменді іздеу бұл хиттердің көпшілігі тек β-сэндвичтерге сәйкес келетінін көрсетті.көптеген белоктарда кездесетін барлық жерде кездесетін қатпар.Далидегі барлық үш іздеу тек бір нәтиже берді: IZUMO1.
SPACA6 және IZUMO1 құрылымдық ұқсастықтары бар екені көптен бері айтылып келеді7,32,37.Осы екі гамета синтезімен байланысты белоктардың эктодомендері тек 21% реттілік сәйкестігін бөліссе де (S8a суреті), сақталған дисульфидті байланыс үлгісін және SPACA6-да болжанған C-терминал Ig-тәрізді доменді қоса алғанда, күрделі дәлелдемелерді құруға ерте әрекет жасауға мүмкіндік берді. Үлгі ретінде IZUMO1 қолданатын A және SPACA6 тінтуірінің гомологиялық үлгісі37.Біздің құрылым бұл болжамдарды растап, шынайы ұқсастық дәрежесін көрсетеді.Іс жүзінде, SPACA6 және IZUMO137,43,44 құрылымдары топса аймағы арқылы қосылған ұқсас 4HB және Ig тәрізді β-сэндвич домендерімен бірдей екі домендік архитектураны (S8b-сурет) бөліседі (S8c сурет).
IZUMO1 және SPACA6 4HB кәдімгі спираль байламдарынан ортақ айырмашылықтарға ие.Типтік 4HBs, 45,46 эндосомалық синтезге қатысатын SNARE протеиндік кешендерінде табылғандар сияқты, орталық ось 47 айналасында тұрақты қисықтылықты сақтайтын біркелкі аралық спиральдарға ие. Керісінше, IZUMO1 және SPACA6 екеуінде де спиральдық домендер бұрмаланған, айнымалы қисықтық және біркелкі емес орау (S8d суреті).1′, 1 және 2 спиральдармен жасалған үшбұрыштан туындаған бұралу IZUMO1 және SPACA6 ішінде сақталады және 1′ спиральдағы бірдей CXXC мотивімен тұрақтанды.Дегенмен, SPACA6-да табылған қосымша дисульфидті байланыс (жоғарыдағы 1 және 2-ші спиральдарды ковалентті байланыстыратын Cys41 және Cys55) үшбұрыштың шыңында өткір төбені жасайды, бұл SPACA6-ны IZUMO1-ге қарағанда көбірек бұралған және қуыс үшбұрыштары айқынырақ етеді.Сонымен қатар, IZUMO1-де SPACA6-да осы қуыстың ортасында байқалған Arg37 жоқ.Керісінше, IZUMO1-де алифатты және хош иісті қалдықтардың әдеттегі гидрофобты өзегі бар.
IZUMO1 қос жіпті және бес тізбекті β-парақтан тұратын Ig тәрізді доменге ие.43.IZUMO1-дегі қосымша жіп SPACA6-дағы орамды ауыстырады, ол жіптегі негізгі сутегі байланыстарын шектеу үшін F тізбегімен әрекеттеседі.Салыстырудың қызықты нүктесі - екі ақуыздың Ig тәрізді домендерінің болжамды беттік заряды.IZUMO1 беті SPACA6 бетіне қарағанда теріс зарядталған.Қосымша заряд сперматозоидты мембранаға қараған С-терминусының жанында орналасқан.SPACA6-да бірдей аймақтар бейтарап немесе оң зарядталған (S8e-сурет).Мысалы, SPACA6 жүйесіндегі гидрофобты бет (жіңішке жиектер) және оң зарядталған шұңқырлар (кеңірек жиектер) IZUMO1-де теріс зарядталған.
IZUMO1 және SPACA6 арасындағы байланыс пен қайталама құрылым элементтері жақсы сақталғанымен, Ig-тәрізді домендердің құрылымдық теңестірілуі екі доменнің бір-біріне қатысты жалпы бағдары бойынша ерекшеленетінін көрсетті (S9-сурет).IZUMO1 спиральды байламы β-сэндвичтің айналасында қисық болып, орталық осьтен шамамен 50° қашықтықта бұрын сипатталған «бумеранг» пішінін жасайды.Керісінше, SPACA6-дағы бұрандалы сәуле қарама-қарсы бағытта шамамен 10° қисайған.Бұл бағдарлардағы айырмашылықтар топса аймағындағы айырмашылықтарға байланысты болуы мүмкін.Бастапқы реттілік деңгейінде IZUMO1 және SPACA6 цистеин, глицин және аспарагин қышқылы қалдықтарын қоспағанда, топсадағы реттілік ұқсастығына ие емес.Нәтижесінде сутегі байланыстары мен электростатикалық желілер мүлдем басқа.β-парақтық қайталама құрылым элементтерін IZUMO1 және SPACA6 ортақ пайдаланады, дегенмен IZUMO1 ішіндегі тізбектер әлдеқайда ұзағырақ және 310 спираль (5 спираль) SPACA6 үшін бірегей.Бұл айырмашылықтар екі ұқсас протеиндер үшін әртүрлі домен бағдарларына әкеледі.
Біздің Dali серверіндегі іздеуіміз SPACA6 және IZUMO1 ақуыздар базасында осы нақты 4HB қатпары бар эксперименталды түрде анықталған екі ғана құрылым екенін анықтады (S1 кесте).Жақында DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold, нейрондық желіге негізделген жүйені әзірледі, ол бастапқы тізбектерден белоктардың 3D құрылымдарын дәл болжай алады48.SPACA6 құрылымын шешкеннен кейін көп ұзамай адам протеомындағы барлық ақуыздардың 98,5% қамтитын болжамды құрылым үлгілерін қамтамасыз ететін AlphaFold деректер базасы шығарылды48,49.Іздеу үлгісі ретінде шешілген SPACA6 құрылымын пайдалана отырып, AlphaFold адам протеомындағы модель үшін құрылымдық гомологиялық іздеу SPACA6 және IZUMO1 құрылымдық ұқсастықтары бар үміткерлерді анықтады.SPACA6 болжаудағы AlphaFold керемет дәлдігін (S10a суреті) ескере отырып, әсіресе біздің шешілген құрылыммен салыстырғанда 1,1 Å rms эктодомен (S10b сурет) — анықталған SPACA6 сәйкестіктерінің дәл болуы ықтимал екеніне сенімді бола аламыз.
Бұрын PSI-BLAST IZUMO1 кластерін сперматозоидпен байланысты басқа үш белокпен іздеген: IZUMO2, IZUMO3 және IZUMO450.AlphaFold бұл IZUMO тұқымдас ақуыздары IZUMO1 сияқты дисульфидті байланыс үлгісімен 4HB доменіне бүктеледі деп болжады (3a және S11-суреттер), бірақ оларда Ig тәрізді домен жоқ.IZUMO2 және IZUMO3 IZUMO1-ге ұқсас бір жақты мембраналық ақуыздар болып табылады, ал IZUMO4 секрецияланған сияқты.IZUMO 2, 3 және 4 ақуыздарының гамета синтезіндегі функциялары анықталмаған.IZUMO3 сперматозоидтардың дамуы кезінде акросома биогенезінде рөл атқаратыны белгілі51, ал IZUMO ақуызы кешен құрайды50.Сүтқоректілерде, бауырымен жорғалаушыларда және қосмекенділерде IZUMO протеиндерінің сақталуы олардың әлеуетті функциясы DCST1/2, SOF1 және FIMP сияқты гамета синтезімен байланысты басқа белгілі ақуыздармен сәйкес келетінін көрсетеді.
Сәйкесінше қызғылт сары, жасыл және көк түстермен бөлінген 4HB, топса және Ig тәрізді домендері бар IST суперотбасысының домен архитектурасының диаграммасы.IZUMO4-те қара болып көрінетін бірегей C-терминал аймағы бар.Расталған және болжамды дисульфидті байланыстар сәйкесінше тұтас және нүктелі сызықтармен көрсетілген.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1Zold (TMEMF1ZF9) және DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) А панелімен бірдей түс диапазонында көрсетіледі. Дисульфидті байланыстар күлгін түсте көрсетілген.TMEM95, IZUMO2 және IZUMO3 трансмембраналық бұрандалары көрсетілмеген.
IZUMO протеинінен айырмашылығы, басқа SPACA ақуыздары (яғни, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 және SPACA9) SPACA6-дан құрылымдық жағынан ерекшеленеді (S12-сурет).Тек SPACA9-да 4HB бар, бірақ ол SPACA6 сияқты параллель-қарсы параллельді бағдарға немесе бірдей дисульфидті байланысқа ие болады деп күтілмейді.Тек SPACA1-де ұқсас Ig тәрізді домен бар.AlphaFold SPACA3, SPACA4 және SPACA5 SPACA6-ға қарағанда мүлдем басқа құрылымға ие деп болжайды.Бір қызығы, SPACA4 ұрықтандыруда рөл атқаратыны белгілі, бірақ SPACA6-ға қарағанда көбірек дәрежеде, оның орнына сперматозоид пен ооцит zona pellucida52 арасындағы өзара әрекеттесуді жеңілдетеді.
Біздің AlphaFold іздеуіміз IZUMO1 және SPACA6 4HB, TMEM95 үшін басқа сәйкестік тапты.TMEM95, бір спецификалық трансмембраналық ақуыз, 32,33 абляциясы кезінде еркек тышқандарды бедеу етеді.TMEM95 жетіспейтін сперматозоидтар қалыпты морфологияға, қозғалғыштыққа және zona pellucida ішіне еніп, жұмыртқа қабығымен байланысу қабілетіне ие болды, бірақ жұмыртқалық мембранамен біріктіре алмады.Алдыңғы зерттеулер TMEM95 IZUMO133-пен құрылымдық ұқсастықтарды бөлісетінін көрсетті.Шынында да, AlphaFold үлгісі TMEM95 IZUMO1 және SPACA6 сияқты CXXC мотивтерінің бірдей жұбы және SPACA6-да табылған 1 және 2 спиральдар арасындағы бірдей қосымша дисульфидті байланысы бар 4HB екенін растады (3a және S11-сурет).TMEM95-те Ig-тәрізді домен жоқ болса да, оның SPACA6 және IZUMO1 топса аймақтарына ұқсас дисульфидті байланыс үлгісі бар аймақ бар (3б-сурет).Осы қолжазбаны жариялау кезінде алдын ала басып шығару сервері AlphaFold53 нәтижесін растайтын TMEM95 құрылымын хабарлады.TMEM95 SPACA6 және IZUMO1-ге өте ұқсас және эволюциялық түрде қосмекенділерде сақталған (4-сурет және S13).
PSI-BLAST іздеуі осы тізбектердің өмір ағашындағы орнын анықтау үшін NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP және SOF1 дерекқорларын пайдаланды.Тармақ нүктелерінің арасындағы қашықтық масштабтау үшін көрсетілмейді.
SPACA6 және IZUMO1 арасындағы таңғаларлық жалпы құрылымдық ұқсастық олардың TMEM95 және IZUMO 2, 3 және 4 ақуыздарын қамтитын сақталған құрылымдық суперотбасының негізін қалаушы мүшелері екенін көрсетеді.белгілі мүшелер: IZUMO1, SPACA6 және TMEM95.Бірнеше мүшеде ғана Ig-тәрізді домендер болғандықтан, IST суперотбасысының белгісі 4HB домені болып табылады, оның осы белоктардың барлығына ортақ бірегей ерекшеліктері бар: 1) Параллельге қарсы/параллель кезектесуінде орналасқан бұрандалары бар ширатылған 4HB (сур. 5a), 2) буманың буманың ішіндегі екі спиралдан және үшінші тік спиральдан тұратын үшбұрышты беті бар (Кілт аймағы (5c-сурет)) Тиоредоксин тәрізді ақуыздарда кездесетін CXXC мотиві қызмет ететіні белгілі. тотығу-тотықсыздану сенсоры ретінде 54,55,56 , ал IST отбасы мүшелеріндегі мотив гамета синтезіндегі ERp57 сияқты протеин дисульфид изомеразаларымен байланысты болуы мүмкін.Рөлдер 57,58 байланысты.
IST суперфамилиясының мүшелері 4HB доменінің үш сипатты белгісімен анықталады: параллель және параллельге қарсы бағдар арасында ауысатын төрт спирал, ба-үшбұрышты спираль шоғырының беттері және шағын молекулалар арасында қалыптасқан ca CXXC қос мотиві.) N-терминал спиральдары (қызғылт сары) және топса аймағы β-шаш түйреуіш (жасыл).
SPACA6 және IZUMO1 арасындағы ұқсастықты ескере отырып, біріншісінің IZUMO1 немесе JUNO-мен байланысу қабілеті тексерілді.Биоқабат интерферометриясы (BLI) кинетикалық негізде байланыстыру әдісі болып табылады, ол бұрын IZUMO1 және JUNO арасындағы өзара әрекеттесу санын анықтау үшін пайдаланылған.Биотинмен таңбаланған сенсорды JUNO талданатын затының жоғары концентрациясы бар жем ретінде IZUMO1 инкубациялауынан кейін сенсор ұшына бекітілген биоматериал қалыңдығының байланыстырудан туындаған өзгерісін көрсететін күшті сигнал анықталды (S14a суреті).Ұқсас сигналдар (яғни, IZUMO1 талданатын затқа қарсы жем ретінде сенсорға қосылған JUNO) (S14b-сурет).SPACA6 сенсормен байланысқан IZUMO1 немесе сенсормен байланысқан JUNO-ға қарсы талдаушы ретінде пайдаланылған кезде ешқандай сигнал анықталмады (S14a, b сурет).Бұл сигналдың болмауы SPACA6 жасушадан тыс домені IZUMO1 немесе JUNO жасушадан тыс доменімен әрекеттеспейтінін көрсетеді.
BLI талдауы жем протеиніндегі бос лизин қалдықтарының биотинилденуіне негізделгендіктен, бұл модификация лизин қалдықтары өзара әрекеттесуге қатысқан жағдайда байланыстыруды болдырмайды.Сонымен қатар, сенсорға қатысты байланыстырудың бағыты стерикалық кедергілер тудыруы мүмкін, сондықтан әдеттегі төмен түсіру талдаулары рекомбинантты SPACA6, IZUMO1 және JUNO эктодомендерінде де орындалды.Осыған қарамастан, SPACA6 His-белгіленген IZUMO1 немесе His-белгіленген JUNO (S14c,d суреті) тұнбаларымен тұнбады, бұл BLI эксперименттерінде байқалғанға сәйкес өзара әрекеттесу жоқтығын көрсетеді.Оң бақылау ретінде біз JUNO-ның таңбаланған His IZUMO1-мен өзара әрекеттесуін растадық (S14e және S15 суреттері).
SPACA6 және IZUMO1 арасындағы құрылымдық ұқсастыққа қарамастан, SPACA6-ның JUNO-ны байланыстыра алмауы таңқаларлық емес.Адамның IZUMO1 бетінде JUNO-мен әрекеттесетін 20-дан астам қалдық бар, оның ішінде үш аймақтың әрқайсысының қалдықтары бар (бірақ олардың көпшілігі топса аймағында орналасқан) (S14f-сурет).Осы қалдықтардың тек біреуі ғана SPACA6 (Glu70) құрамында сақталады.Көптеген қалдық алмастырулар бастапқы биохимиялық қасиеттерін сақтағанымен, IZUMO1-дегі маңызды Arg160 қалдығы SPACA6-дағы теріс зарядталған Asp148-ге ауыстырылды;алдыңғы зерттеулер IZUMO1-дегі Arg160Glu мутациясының JUNO43-пен байланысуды толығымен дерлік жоятынын көрсетті.Сонымен қатар, IZUMO1 және SPACA6 арасындағы домен бағдарындағы айырмашылық SPACA6-дағы эквивалентті аймақтың JUNO-байланыстыратын учаскесінің бетінің ауданын айтарлықтай арттырды (S14g сурет).
Гамета синтезі үшін SPACA6-ның белгілі қажеттілігіне және оның IZUMO1-ге ұқсастығына қарамастан, SPACA6-да JUNO-ны байланыстырудың баламалы функциясы жоқ сияқты.Сондықтан біз құрылымдық деректерімізді эволюциялық биологияның маңыздылығы туралы дәлелдермен біріктіруге тырыстық.SPACA6 гомологтарының реттілігі сүтқоректілерден тыс жалпы құрылымның сақталуын көрсетеді.Мысалы, цистеин қалдықтары тіпті алыс туыстас қосмекенділерде де болады (6а-сурет).ConSurf серверін пайдаланып, 66 реттіліктен тұратын бірнеше ретті туралауды сақтау деректері SPACA6 бетіне салыстырылды.Талдаудың бұл түрі белок эволюциясы кезінде қандай қалдықтардың сақталғанын көрсете алады және қандай беттік аймақтар функцияда рөл атқаратынын көрсете алады.
a CLUSTAL OMEGA көмегімен дайындалған 12 түрлі түрдегі SPACA6 эктодомендерінің реттілігі.ConSurf талдауына сәйкес, ең консервативті позициялар көк түспен белгіленген.Цистеин қалдықтары қызыл түспен белгіленген.Домен шекаралары және қайталама құрылым элементтері туралаудың жоғарғы жағында көрсетілген, мұнда көрсеткілер β-жіптерді, ал толқындар бұрандаларды көрсетеді.Тізбектерді қамтитын NCBI рұқсат идентификаторлары мыналар: адам (Homo sapiens, NP_001303901), мандрил (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), капучин маймымы (Cebus mimic, XP_017359366), шарлы жылқы (E017359366) us orca3_23 XP_032_034) .), қой (Ovis aries, XP_014955560), піл (Loxodonta africana, XP_010585293), ит (Canis lupus familyis, XP_025277208), тінтуір (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian_01vil (Tasmanian_01, XP31, XP36) 318), Платипус, 8) , 61_89 және Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Нөмірлеу адамның тәртібіне негізделген.b Жоғарғы жағында 4HB және төменгі жағында Ig тәрізді домені бар SPACA6 құрылымының беткі көрінісі, ConSurf серверінің сақтау бағалауларына негізделген түстер.Ең жақсы сақталған бөліктері көк түспен, орташа сақталған бөліктері ақ түспен, ал ең аз сақталғаны сары түспен.күлгін цистеин.Қорғаудың жоғары деңгейін көрсететін үш беттік патч таңбаланған 1, 2 және 3 патчтарында көрсетілген. 4HB мультфильмі жоғарғы оң жақтағы кірістірмеде көрсетілген (бір түс схемасы).
SPACA6 құрылымында жоғары сақталған үш беттік аймақ бар (6б-сурет).1-патч 4HB және топса аймағын қамтиды және екі сақталған CXXC дисульфидті көпірі, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 топса желісі (S7-сурет) және үш сақталған сыртқы хош иісті қалдықтар (Phe31, Tyr73, Phe137) бар.сперматозоид бетіндегі бірнеше оң зарядталған қалдықтарды білдіретін Ig тәрізді доменнің кеңірек жиегі (S6e-сурет).Бір қызығы, бұл патчта бұрын SPACA6 30 функциясына кедергі келтіретін антидене эпитопы бар.3-аймақ Ig тәрізді доменнің топсасын және бір жағын қамтиды;бұл аймақта сақталған пролиндер (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) және сыртқа қарайтын полярлы/зарядталған қалдықтар бар.Бір таңқаларлығы, 4HB бетіндегі қалдықтардың көпшілігі өте өзгермелі (6б-сурет), бірақ қатпар SPACA6 гомологында (гидрофобты байлам ядросының консерватизмімен көрсетілген) және IST суперфамилиясынан тыс жерде сақталады.
Бұл SPACA6 ішіндегі ең аз анықталатын қайталама құрылым элементтері бар ең кіші аймақ болса да, көптеген топса аймағы қалдықтары (соның ішінде 3 аймақ) SPACA6 гомологтары арасында жоғары деңгейде сақталған, бұл бұрандалы байлам мен β-сэндвичтің бағдары рөл атқаратынын көрсетуі мүмкін.консерватор ретінде.Дегенмен, SPACA6 және IZUMO1 топса аймағындағы кең көлемді сутегі байланысы мен электростатикалық желілерге қарамастан, IZUMO137,43,44 бірнеше рұқсат етілген құрылымдардың туралануынан ішкі икемділіктің дәлелін көруге болады.Жеке домендердің туралануы жақсы қабаттасады, бірақ домендердің бір-біріне қатысты бағдары орталық осьтен 50°-тан 70°-қа дейін өзгерді (S16-сурет).Ерітіндідегі SPACA6 конформациялық динамикасын түсіну үшін SAXS тәжірибелері орындалды (S17a,b-сурет).SPACA6 эктодоменінің Ab initio реконструкциясы таяқшаның кристалдық құрылымына (S18-сурет) сәйкес келді, дегенмен Кратки сызбасы белгілі бір икемділік дәрежесін көрсетті (S17b-сурет).Бұл конформация IZUMO1-ге қайшы келеді, онда байланыспаған ақуыз торда да, ерітіндіде де бумеранг пішінін қабылдайды43.
Икемді аймақты арнайы анықтау үшін SPACA6 құрылғысында сутегі-дейтерий алмасу масс-спектроскопиясы (H-DXMS) орындалды және IZUMO143-те бұрын алынған деректермен салыстырылды (7а,б-сурет).SPACA6 IZUMO1-ге қарағанда икемдірек, бұл 100 000 с алмасудан кейін құрылым бойынша жоғары дейтерий алмасуымен көрсетілген.Екі құрылымда да топса аймағының С-терминал бөлігі алмасудың жоғары деңгейін көрсетеді, бұл бір-біріне қатысты 4HB және Ig-тәрізді домендердің шектеулі айналуына мүмкіндік береді.Бір қызығы, 147CDLPLDCP154 қалдығынан тұратын SPACA6 топсасының C-терминалды бөлігі жоғары деңгейде сақталған 3 аймақ болып табылады (сурет 6b), мүмкін доменаралық икемділік SPACA6 эволюциялық сақталған ерекшелігі екенін көрсетуі мүмкін.Икемділік талдауына сәйкес CD термиялық балқыма деректері SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) қарағанда тұрақты емес екенін көрсетті (S1e және S19-сурет).
a SPACA6 және b IZUMO1 H-DXMS кескіндері.Көрсетілген уақыт нүктелерінде дейтерийдің пайыздық алмасуы анықталды.Сутегі-дейтерий алмасу деңгейлері көктен (10%) қызылға (90%) дейін градиент шкаласының түсімен белгіленеді.Қара жәшіктер жоғары алмасу аймақтарын білдіреді.Кристалл құрылымында байқалатын 4HB, топса және Ig-тәрізді домен шекаралары бастапқы реттілік үстінде көрсетілген.10 с, 1000 с және 100 000 с аралығындағы дейтерий алмасу деңгейлері SPACA6 және IZUMO1 мөлдір молекулалық беттеріне салынған жолақ диаграммасында сызылған.Дейтерий алмасу деңгейі 50% төмен құрылымдардың бөліктері ақ түсті.H-DXMS алмасуының 50% жоғары аймақтары градиент масштабында боялған.
CRISPR/Cas9 және тінтуірдің гендік нокаутының генетикалық стратегияларын пайдалану сперматозоид пен жұмыртқаны байланыстыру және біріктіру үшін маңызды бірнеше факторларды анықтауға әкелді.IZUMO1-JUNO және CD9 құрылымының жақсы сипатталған өзара әрекеттесуінен басқа, гамета синтезімен байланысты ақуыздардың көпшілігі құрылымдық және функционалды жұмбақ болып қалады.SPACA6 биофизикалық және құрылымдық сипаттамасы ұрықтандыру кезінде адгезия/фузия молекулалық басқатырғыштың тағы бір бөлігі болып табылады.
SPACA6 және IST супертүрінің басқа мүшелері сүтқоректілерде, сондай-ақ жекелеген құстарда, бауырымен жорғалаушылар мен қосмекенділерде жоғары деңгейде сақталған сияқты;шын мәнінде, SPACA6 тіпті зебра балығын ұрықтандыру үшін қажет деп саналады 59. Бұл таралу DCST134, DCST234, FIMP31 және SOF132 сияқты гамета синтезімен байланысты басқа белгілі ақуыздарға ұқсас, бұл факторлардың HAP2 жетіспейтінін көрсетеді (сонымен бірге). GCS1 ретінде белгілі) көптеген протистердің каталитикалық белсенділігіне жауап беретін белоктар., өсімдіктер және буынаяқтылар.Ұрықтанған синтез белоктары 60, 61. SPACA6 және IZUMO1 арасындағы күшті құрылымдық ұқсастыққа қарамастан, осы белоктардың кез келгенін кодтайтын гендердің нокаутқа ұшырауы аталық тышқандарда бедеулікке әкелді, бұл олардың гамета синтезіндегі функцияларының қайталанбайтынын көрсетеді..Кеңірек айтқанда, синтездің адгезия фазасы үшін қажет белгілі сперматозоидтардың ешқайсысы артық емес.
SPACA6 (және IST супержанұясының басқа мүшелері) гаметикалық қосылыстарға қатыса ма, маңызды ақуыздарды біріктіру нүктелеріне тарту үшін интрагаметикалық желілерді қалыптастыра ма, немесе тіпті мүмкін емес фузогендер ретінде әрекет ете ме, бұл ашық сұрақ болып қала береді.HEK293T жасушаларында бірлескен иммунопреципитация зерттеулері толық ұзындықтағы IZUMO1 және SPACA632 арасындағы өзара әрекеттесуді анықтады.Дегенмен, біздің рекомбинантты эктодомендер in vitro өзара әрекеттеспеді, бұл Noda және т.б.конструкцияда екеуі де жойылды (ұрықтандыру үшін қажет емес екендігі көрсетілген IZUMO1 цитоплазмалық құйрығына назар аударыңыз62).Балама ретінде, IZUMO1 және/немесе SPACA6 біз in vitro-да шығармайтын арнайы байланыстыру орталарын талап етуі мүмкін, мысалы, физиологиялық ерекше конформациялар немесе құрамында басқа ақуыздар (белгілі немесе әлі ашылмаған) бар молекулалық кешендер.IZUMO1 эктодомені перивителлиндік кеңістікте сперматозоидтардың жұмыртқаға қосылуына делдал болады деп есептелсе де, SPACA6 эктодоменінің мақсаты түсініксіз.
SPACA6 құрылымы ақуыз-белок өзара әрекеттесуіне қатысатын бірнеше сақталған беттерді көрсетеді.CXXC мотивіне тікелей іргелес топса аймағының сақталған бөлігінде (жоғарыда 1-патч белгіленді) биомолекулалар арасындағы гидрофобты және π қабаттасатын әрекеттесулермен жиі байланысты болатын бірнеше сыртқа бағытталған хош иісті қалдықтар бар.Ig-тәрізді доменнің кең жақтары (2-аймақ) жоғары сақталған Arg және Оның қалдықтары бар оң зарядталған ойықты құрайды және осы аймаққа қарсы антиденелер бұрын гамета синтезін блоктау үшін пайдаланылған 30 .Антидене 212RIRPAQLTHRGTFS225 сызықты эпитопын таниды, онда алты аргинин қалдығының үшеуі бар және жоғары деңгейде сақталған His220.Функцияның бұзылуы осы ерекше қалдықтардың немесе бүкіл аймақтың бітелуіне байланысты ма, бұл анық емес.Бұл саңылаудың β-сэндвичтің С-терминусына жақын орналасуы көрші сперматозоидтармен cis- әрекеттесуін көрсетеді, бірақ ооцит ақуыздарымен емес.Сонымен қатар, топса ішінде жоғары икемді пролинге бай шатасудың (3-сайт) сақталуы ақуыз-ақуыз әрекеттесу орны болуы мүмкін немесе, ең алдымен, екі домен арасындағы икемділіктің сақталуын көрсетеді.SPACA6 белгісіз рөлі үшін жыныс маңызды.гаметалардың қосылуы.
SPACA6 жасушааралық адгезия ақуыздарының, соның ішінде Ig тәрізді β-сэндвичтердің қасиеттеріне ие.Көптеген адгезивті протеиндер (мысалы, кадериндер, интегриндер, адгезиндер және IZUMO1) ақуыздарды жасуша мембранасынан қоршаған орта мақсаттарына дейін ұзартатын бір немесе бірнеше β-сэндвич домендеріне ие63,64,65.SPACA6 Ig-тәрізді домені сонымен қатар адгезия мен біріктірудің β-сэндвичтерінде жиі кездесетін мотивті қамтиды: механикалық қысқыштар деп аталатын β-сэндвичтердің ұштарында параллельді жіптердің дублеттері66.Бұл мотив ығысу күштеріне төзімділікті арттырады деп саналады, бұл жасушааралық өзара әрекеттесуге қатысатын ақуыздар үшін құнды.Дегенмен, адгезиндерге ұқсастығына қарамастан, қазіргі уақытта SPACA6 жұмыртқаның ақтығымен әрекеттесетініне ешқандай дәлел жоқ.SPACA6 эктодомені JUNO-мен байланыса алмайды, ал SPACA6-экспрессиялайтын HEK293T жасушалары, мұнда көрсетілгендей, 32 аймағы жоқ ооциттермен әрең әрекеттеседі.Егер SPACA6 гаметикалық байланыс орнатса, бұл өзара әрекеттесулер трансляциядан кейінгі модификацияларды немесе басқа сперматозоидтар арқылы тұрақтандыруды қажет етуі мүмкін.Соңғы гипотезаны растау үшін IZUMO1 жетіспейтін сперматозоидтар ооциттермен байланысады, бұл IZUMO1-ден басқа молекулалардың гамета адгезиясының 27 қадамына қатысатынын көрсетеді.
Көптеген вирустық, жасушалық және дамып келе жатқан синтездік ақуыздардың фузогендер ретіндегі қызметін болжайтын қасиеттері бар.Мысалы, вирустық синтез гликопротеиндерінде (I, II және III кластар) қожайынның мембранасына енгізілген ақуыздың соңында гидрофобты синтездік пептид немесе ілмек болады.IZUMO143 гидрофильділік картасы және IST супертүрінің құрылымы (анықталған және болжанған) айқын гидрофобты синтездік пептидті көрсетпеді.Осылайша, егер IST суперфамилиясындағы кез келген белоктар фузоген ретінде қызмет етсе, олар мұны басқа белгілі мысалдардан өзгеше түрде жасайды.
Қорытындылай келе, гамета синтезімен байланысты белоктардың IST суперфамилиясының мүшелерінің функциялары таң қалдыратын құпия болып қала береді.Біздің сипатталған SPACA6 рекомбинантты молекуласы және оның шешілген құрылымы осы ортақ құрылымдар арасындағы қарым-қатынастарды және олардың гаметаларды бекітудегі және біріктірудегі рөлін түсінуге мүмкіндік береді.
Адамның болжамды SPACA6 эктодоменіне сәйкес келетін ДНҚ тізбегі (NCBI қосылу нөмірі NP_001303901.1; қалдық 27-246) Drosophila melanogaster S2 жасушаларында экспрессия үшін кодон-оңтайландырылған және ген фрагменті ретінде синтезделген Kozakics encofinding тізбегі., BiP секреция сигналы және сәйкес 5′ және 3′ ұштары пуромицинмен (pMT-пуро) таңдау үшін модификацияланған металлотионеин промоторына негізделген pMT экспрессия векторына осы генді байлаудан тәуелсіз клондау үшін.pMT-puro векторы 10x-His C-терминал тегімен кейін тромбиннің бөліну орнын кодтайды (S2 сурет).
SPACA6 pMT-puro векторының D. melanogaster S2 (Gibco) жасушаларына тұрақты трансфекциясы IZUMO1 және JUNO43 үшін қолданылатын хаттамаға ұқсас орындалды.S2 жасушалары ерітілді және Шнайдер ортасында (Гибко) өсірілді, соңғы концентрациясы 10% (көлем/көлем) ұрықтың бұзау сарысуы (Гибко) және 1X антимикоздық антибиотик (Gibco) қосылған.Ерте өту жасушалары (3,0 x 106 ұяшық) 6 шұңқырлы пластиналардың (Корнинг) жеке ұңғымаларында қапталған.27°C температурада 24 сағат инкубациялаудан кейін жасушалар өндірушінің хаттамасына сәйкес SPACA6 pMT-puro векторының 2 мг қоспасымен және Effectene трансфекциялық реагентімен (Qiagen) трансфекцияланды.Трансфекцияланған жасушалар 72 сағат бойы инкубацияланды, содан кейін 6 мг/мл пуромицинмен жиналды.Содан кейін жасушалар толық Шнайдер ортасынан бөлініп алынды және үлкен көлемде ақуыз өндіру үшін сарысусыз Insect-XPRESS ортасына (Лонза) орналастырылды.S2 жасуша культурасының 1 л партиясы 2 л желдетілетін жалпақ түбі бар полипропилен Эрленмейер колбасында 8–10 × 106 мл-1 ұяшыққа дейін өсірілді, содан кейін 500 мкМ CuSO4 (Millipore Sigma) соңғы концентрациясымен зарарсыздандырылды және стерильді сүзгіден өтті.индукцияланған.Индукцияланған дақылдар төрт күн бойы 27° C. 120 айн/мин инкубацияланды.
Құрамында SPACA6 бар шартты орта 10 кДа MWCO мембранасы бар Centramate тангенциалды ағынды сүзу жүйесі (Pall Corp) арқылы 4°C температурада 5660 × г центрифугалау арқылы оқшауланды.2 мл Ni-NTA агарозды шайырға (Qiagen) SPACA6 бар шоғырланған ортаны жағыңыз.Ni-NTA шайыры 50 мМ соңғы имидазол концентрациясын алу үшін А буферінің 10 баған көлемімен (CV) жуылды, содан кейін 1 CV A буфері қосылды.SPACA6 500 мМ түпкілікті концентрацияға дейін имидазол қосылған 10 мл А буферімен элюцияланды.Шектеу класы тромбин (Millipore Sigma) диализ түтігіне (MWCO 12-14 кДа) 1 бірлікте SPACA6 мг-ға қарсы 1 L 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5 және 150 мМ NaCl (В буфері) диализ үшін тікелей қосылды.) 4°C температурада 48 сағат.Содан кейін тромбинмен бөлінген SPACA6 тұз концентрациясын төмендету үшін үш есе сұйылтылды және 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5 теңестірілген 1 мл MonoS 5/50 GL катион алмасу бағанына (Cytiva/GE) жүктелді.Катионалмастырғыш 3 OK 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, содан кейін SPACA6 0-ден 500 мм NaCl-ге дейінгі сызықтық градиентпен 10 мм Tris-HCl, pH 7,5 25 OK үшін элюцияланды.Ион алмасу хроматографиясынан кейін SPACA6 1 мл-ге дейін концентрленді және B буферімен теңестірілген ENrich SEC650 10 x 300 бағанынан (BioRad) изократикалық түрде элюцияланды. Хроматограммаға сәйкес, құрамында SPACA6 бар пул және концентрат фракциялары.Тазалық 16% SDS-полиакриламидті гельде Coomassie-боялған электрофорез арқылы бақыланды.Протеин концентрациясы Бер-Ламберт заңы мен теориялық молярлық өшу коэффициенті арқылы 280 нм абсорбент арқылы сандық анықталды.
Тазартылған SPACA6 түні бойы 10 мМ натрий фосфатына, рН 7,4 және 150 мМ NaF-қа қарсы диализден өтті және CD спектроскопиясы арқылы талдау алдында 0,16 мг/мл дейін сұйылтылды.Толқын ұзындығы 185-тен 260 нм-ге дейінгі ықшам дискілерді спектрлік сканерлеу Jasco J-1500 спектрополяриметрінде 50 нм/мин жылдамдықпен 25°C температурада 1 мм оптикалық жол ұзындығы (Helma) бар кварц кюветтерін пайдаланып жиналды.CD спектрлері бастапқы түзетілді, 10 алудан астам орташа алынған және см2/дмоль градусындағы орташа қалдық эллипстікке (θMRE) түрлендірілді:
мұндағы МВт - Да-дағы әрбір үлгінің молекулалық салмағы;N – аминқышқылдарының саны;θ - миллиградустағы эллипстік;d оптикалық жолдың см ұзындығына сәйкес келеді;бірліктегі ақуыз концентрациясы.