310 10*1мм Тот баспайтын болаттан жасалған ширатылған түтіктің химиялық құрамдас бөлігі, Спидроиннің N-терминалды домендері амилоидты фибрилдерге негізделген гидрогельдерді құрайды және ақуызды иммобилизациялау үшін платформаны қамтамасыз етеді.

Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Әр слайдта үш мақаланы көрсететін слайдерлер.Слайдтар арқылы жылжу үшін артқа және келесі түймелерді немесе әр слайд бойынша жылжу үшін соңында слайд контроллері түймелерін пайдаланыңыз.

Техникалық сипаттама

310 10*1мм тот баспайтын болаттан жасалған бұралған түтіктерді жеткізушілер

Химиялық құрамы

Механикалық қасиеттері

Рекомбинантты өрмекші жібек ақуыздары (өрмекші жібек ақуыздары) жаңа биоматериалдарды әзірлеуде көптеген әлеуетті қолданбаларға ие, бірақ олардың мультимодальды және агрегацияға бейімділігі оларды алуды қиындатады және пайдалануды жеңілдетеді.Мұнда біз рекомбинантты миниатюралық спидроин протеиндері және, ең бастысы, N-терминалды доменнің (NT) өзі 37 ° C температурада өзін-өзі қолдайтын және мөлдір гидрогельдерді тез түзетінін хабарлаймыз.NT және жасыл флуоресцентті ақуыздан немесе пуриндік нуклеозид фосфорилазадан тұратын синтез белоктары толық функционалды синтез белоктарын құрайды.Гидрогельдер.Біздің нәтижелеріміз рекомбинантты NT және синтез белоктары жоғары экспрессиялық өнімділікті қамтамасыз ететінін және гидрогельдерге мөлдірлік, айқаспасыз гельдену және жоғары тығыздықта белсенді ақуыздарды тікелей иммобилизациялау сияқты тартымды қасиеттерді беретінін көрсетеді.
Өрмекшілерде жеті түрлі жібек бездері бар, олардың әрқайсысы жібектің белгілі бір түрін шығарады.Жібектің барлық жеті түрі ұзындығы шамамен 6000 қалдық өрмекші жібек ақуыздарынан (спидроиндер) тұрады және сфералық N- және С-терминал домендерімен (NT және CT) қоршалған үлкен орталық қайталау аймағын қамтиды1,2.Жібектің ең көп зерттелген түрі біріншілік ампуланы бастапқы ампула безі жасайды.Бұл безде эпителий жасушаларының бір қабаты спидроин белоктарын синтездейді және оларды бездің люменіне шығарады, онда олар өте жоғары концентрацияда (30-50% с/т) еритін түрде (допинг) болады3,4.Бездегі негізгі ампулярлы спидроин белоктарының ұйымдастырылуы мен конформациясы талқыланды, бірақ тәжірибелік дәлелдемелердің көпшілігі әдетте спиральді және/немесе кездейсоқ спираль тәрізді конформацияның және мицеллярлы немесе пластинкалы құрылымдардың болуын көрсетеді5,6,7,8,9,10.Қайталанатын домендер жібек талшықтарының механикалық қасиеттерін реттесе, β-парақтық нанокристалдар мен аморфты құрылымдарды құрайды11,12,13,14,15, соңғы домендер жібек безінің бойындағы өзгеретін жағдайларға жауап ретінде жібек талшықтарын реттейді16,17,18.Жібек түзілуін бақылау арқылы 19. Терминал домендері эволюциялық түрде сақталады және олардың қызметі барлық спидроин белоктарына ортақ болуы мүмкін 2,20,21.Без арқылы өту кезінде спидроиннің рН шамамен 7,6-дан < 5,716-ға дейін төмендейді және біртіндеп тарылатын түтік арқылы қозғалу арқылы ығысу мен созылу арқылы артады.Ерітіндіде CT α-спиральді құраушы параллель димер17, бірақ төмен рН және ығысу күштеріне жауап ретінде CT ашылады және β-қабаттарды16, 17 ауыстырады, мүмкін Convert 16 қайталанатын аймақтарында β-қабаттарды іске қосады. NT мономерлі болып табылады. бездің люменіндегі жағдайларды көрсететін және спидроиннің ерігіштігін көрсететін жағдайлар, бірақ төмендетілген рН кезінде бірқатар карбон қышқылының бүйірлік тізбектерінің протондануы шамамен 6,5 pKa бар НТ димеризациясына әкеледі, осылайша НТ тұрақтандырады және үлкен мөлшерде спидроин бекітіледі. шамалар.желілер16,18.Осылайша, NT жабындағы мономерден талшықтағы димерге ауысып, жіп түзілуде шешуші рөл атқарады23,24,25.NT бүгінгі күнге дейін зерттелген барлық шарттарда жоғары еритін және бұрандалы болып қалады16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, бұл оның гетерологиялық ақуыздарды өндіру үшін ерігіштігін арттыратын белгі ретінде дамуына шабыттандырды.
Бір NT, бір қысқа қайталанатын аймақ, бір CT және тазартуға арналған His6 белгісінен (His-NT2RepCT) тұратын рекомбинантты шағын өрмекші жібек протеині табиғи өрмекші жібек ақуызы сияқты сулы буферде ериді және жібек өрмекшінің жергілікті маңызды сипаттамаларына ұқсайды. .қамту 25.31.His-NT2RepCT рН 8 еритін жабын рН 525,32,33,34,35 су моншасына экструдталған биомиметикалық машинаны пайдаланып үздіксіз талшықтарға айналдыруға болады.His-NT2RepCT экспрессиясы бар E. coli биореакторының ашытуы және кейінгі өңдеу тазартудан кейін >14 г/л өнімге әкелді.His-NT2RepCT жоғары өнімділігі, жоғары ерігіштігі және қышқылдық жағдайларға адекватты жауап беруі NT23, 25, 34-ке жатады.
Мұнда біз протеин ерітіндісін 37 °C температурада инкубациялау арқылы рекомбинантты спидроин ақуыздарынан, соның ішінде тек НТ-дан мөлдір гидрогельдердің жылдам түзілуі туралы хабарлаймыз.Тиофлавин T флуоресценциясын (ThT), Фурье түрлендіру инфрақызыл спектроскопиясын (FTIR), ядролық магниттік-резонансты спектроскопияны (ЯМР) және трансмиссиялық электронды микроскопияны (TEM) пайдалана отырып, біз NT және микроөрмекші белоктары β-парақтарға және амилоид тәрізді фибрилдерге құрылымдық трансформациядан өтетінін анықтадық. гельдер пайда болған кезде.Сонымен қатар, NT және жасыл флуоресцентті протеиннің (GFP) немесе пуриндік нуклеозид-фосфорилазаның (PNP) синтез белоктары толық жұмыс істейтін синтез фрагменттері бар гидрогельдерді құрайды.Физиологиялық жағдайларда гидрогельдердің тез түзілуімен бірге гетерологиялық қожайындардағы жоғары өткізу қабілеттілігі инженерлік функциялары бар гидрогельдерді үнемді өндіру мүмкіндігін ашады.
Көптеген хабарланған рекомбинантты спидроин ақуыздарынан36 айырмашылығы, His-NT2RepCT рН 8 кезінде Tris-HCl буферінде тұрақты және жауын-шашынсыз 500 мг/мл дейін концентрациялануы мүмкін25.Сондықтан бұл ақуыздың 37°С-та инкубациялау кезінде оптикалық мөлдір, өздігінен жүретін гидрогельдерді тез түзетіні бізді таң қалдырды (сурет 1b-d).Әрі қарай жүргізілген зерттеулер His-NT2RepCT гельденуі ақуыз концентрацияларының кең ауқымында (10–300 мг/мл) орын алғанын және бұл концентрация гельдену уақытымен кері корреляцияланғанын көрсетті (1c-сурет және Қосымша 1-сурет).His-NT2RepCT қай бөліктері гидрогель түзілуіне делдал болатынын білу үшін біз әр доменді жеке және әртүрлі комбинацияларда колбаны инверсиялық талдау арқылы зерттедік (1а,б-сурет).Рекомбинантты спидроиннің барлық тексерілген фракциялары тұндырылған 2Репті қоспағанда, 1 сағаттан аз уақыт ішінде гельдерді (300 мг/мл ақуыз концентрациясында) түзді (1б-сурет).Бұл тек қана NT және CT біріктірілген немесе қайталанулармен байланысты 37°C температурада гельдене алатынын және His6 тегі бұл процеске айтарлықтай әсер етпейтінін көрсетеді.NT жоғары еритін және тұрақты ақуыз және рекомбинантты спидроин гидрогельдері туралы алдыңғы есептер қайталанатын аймақтардағы және/немесе КТ-лардағы конформациялық өзгерістерге гельдену әсерлерін жатқызған деген жалпы түсінікті ескере отырып, NT өзі мүмкін.Желизацияның ашылуы күтпеген болды.Қосымша кесте 1) 37, 38, 39. Бір қызығы, NT ≥ 300 мг/мл концентрацияда 10 минут ішінде гельденді (1c-сурет).Әртүрлі NT концентрациясы бар құты инверсиясы бойынша эксперименттер >50 мг/мл NT ерітіндісінің сәйкес концентрациядағы His-NT2RepCT қарағанда тезірек гельденетінін көрсетті (салм/көлем, 1c сурет).
Осы жұмыста зерттелген әртүрлі спидроин құрылымдарының схемалық көрінісі.b Әр түрлі рекомбинантты спидроин ақуыздары үшін 37 °C гель уақыты (300 мг/мл) құтыны төңкеру арқылы расталған.CT гелі бірден инкубациясыз (<300 мг/мл), 2Rep тұнбалары (300 мг/мл, 5 мм шкаласы).c 37°C температурада көрсетілген ақуыз концентрацияларында His-NT2RepCT және NT гель уақыты.d His-NT2RepCT және NT гидрогельдерінің астында паук және тиісінше басып шығарылған «NT» әрпі бар фотосуреттер (екеуі де 200 мг/мл, масштаб жолағы 5 мм).
Әртүрлі рекомбинантты спидроин белоктарынан түзілген гидрогельдердің түстері аздап ерекшеленеді, ал жалаңаш көзбен бақылау әр түрлі мөлдірлік дәрежесін көрсетеді (1б-сурет).NT гельдері өте мөлдір, ал басқа гельдер мөлдір емес болады.Цилиндрлік түтіктерге құйылған His-NT2RepCT және NT гельдерін қалыптан бүлінбеген күйде алуға болады (1d-сурет).
Табиғи өрмекші жібек жабындары рекомбинантты спидроин белоктарының гельденуін тудыратын жағдайда гель болатынын тексеру үшін швед көпір өрмекшінің (Larinioides sclopetarius) үлкен ампула безінен жабындар жиналды.Қаптамалар 20 мМ Tris-HCl буферінде 50 мг/мл (өлшенген құрғақ салмақ негізінде) сақталды, бірақ 37 °C температурада 21 күндік инкубация кезінде гельдену байқалмады (қосымша 2а сурет).
Бұл гельдердің мөлшерін анықтау үшін реологиялық өлшемдерді гельдену процесін зерттеу және жалпы механикалық қасиеттерді анықтау үшін қолдануға болады.Атап айтқанда, жоғары температурада сақтау модулін (икемділігін) бақылау гельдеу температурасы, сондай-ақ жабынның тұтқыр серпімді қасиеттері туралы ақпаратты бере алады.Температураны көтеру эксперименттері (25-45°C температурада 1°C/мин пайдалану, табиғи жібек ерітінділерін пайдаланған алдыңғы зерттеулерге негізделген)40,41 His-NT2RepCT және NT ерітінділерінің сақтау модульдері температураның жоғарылауымен өсетінін көрсетті.ұлғайтылды (2-сурет және қосымша 3-сурет).Атап айтқанда, NT модулі His-NT2RepCT-пен салыстырғанда төмен температурада өсе бастады, бұл NT His-NT2RepCT-пен 37°C температурада тікелей инкубацияланған кезде байқалған жылдамырақ гель уақытына сәйкес келеді (1-сурет).Температураның кейінгі төмендеуінен кейін сақтау модулі төменгі мәндерге оралмады және жоғалту модулінен жоғары қалды (Қосымша 3-суретті қараңыз), бұл термиялық қайтымсыз тұрақты гельденуді көрсетеді.Гельденгеннен кейін соңғы серпімділік модулі 100–500 мг/мл концентрациядағы His-NT2RepCT гидрогельдері үшін 15-тен 330 кПа-ға дейін, ал NT гидрогельдері үшін (100–500 мг/мл) соңғы серпімділік модулі 2-ден 1400-ге дейін ауытқиды. кПа (сурет, 2 және рампаның толық деректері) Қосымша 3-суретті қараңыз).
a His-NT2RepCT (300 мг/мл) және b NT (300 мг/мл) шайқау арқылы өлшеу кезінде температураның өзгеруі.Көрсеткілер температура тенденциясын көрсетеді, ал сақтау модулі деректерінің жеңілірек көлеңкесі шудың жоғарылауының себебі болып табылатын өндіруші көрсеткеннен аспап үшін төмен момент мәндерінде сынақты бейнелейді.c Жоғары температурадан кейін (100, 300 және 500 мг/мл) His-NT2RepCT және NT модулінің соңғы жинақталуы.Барлық модуль көрсеткіштері 0,1 Гц жиілікте қабылданады.
Гельденумен байланысты конформациялық өзгерістерді зерттеудің әлеуетті әдісі ретінде біз 37°C температурада гельденуге дейін және одан кейін His-NT2RepCT және NT FTIR спектрлерін тіркедік (3a,b-сурет).Күтілгендей, His-NT2RepCT және NT ерітінділерінің спектрлері 1645 см-1 айқын жолағы бар α-спираль/кездейсоқ катушканың қайталама құрылымын көрсететін ақуыздарға сәйкес келді.Екі гидрогель үшін де гельдену нәтижесінде ортаңғы I жолақта шамамен 1617 см-1 және 1695 см-1 (3а, б-сурет) екі қолдың пайда болуына әкелді, бұл параллельге қарсы β-парақ құрылымдарының пайда болуын көрсетеді.Бұл өзгерістерді тиісті екінші туынды және айырмашылық гельдік спектрлерде де анық көруге болады (Қосымша 4b-сурет).NT β-қабатының екі жолағы His-NT2RepCT жолақтарына қарағанда айқынырақ болды, бұл NT гидрогельіндегі β-қабат жолақтарының жалпы мазмұны NT2RepCT гидрогеліне қарағанда жоғары екенін көрсетеді.
His-NT2RepCT және b NT (екеуі де 500 мг/мл) 37°C инкубацияға дейін (ерітінді) және (гель) кейін FTIR сіңіру спектрлері.c Қайта суспензияланған 50 мг/мл NT2RepCT гельдерінің TEM кескіндері және d NT.Масштаб жолағы 200 нм.e His-NT2RepCT және NT гидрогельдерінің талшықтарының диаметрлері.n = 100 өлшенген фибрилдер, p <0,0001.Қате жолақтары стандартты ауытқуды көрсетеді.Қате жолақтарының ортасы орташа мән болып табылады.Статистикалық талдау үшін жұпталмаған t-тест (екі құйрықты) пайдаланылды.f Әртүрлі рекомбинантты спидроин ақуыздарының ThT флуоресценциясы (100 мг/мл) 37 °C температурада шайқаусыз.g 0%, 5%, 10% және 20% тұқымдары бар 100 мг/мл NT гелінен NT (100 мг/мл) егу эксперименттері.
Трансмиссиялық электронды микроскопия (ТЭМ) көмегімен гельді талдау гидрогельдің амилоид тәрізді фибрилдерден тұратынын көрсетті (3c, 3d-суреттер).NT-түзілген фибрилдер ұзартылған (диаметрі 5-12 нм) және тармақталмаған, ал His-NT2RepCT фибрилдері ұзындығы бойынша қысқа және диаметрі айтарлықтай кең (7-16 нм) болды (3e-сурет).Бұл нәтижелер фиброздың кинетикасын тиофлавин T (ThT) талдауы арқылы қадағалауға мүмкіндік берді.Барлық рекомбинантты спидроин ақуыздары үшін үлгілер 37 °C температурада инкубацияланған кезде флуоресцентті сигнал жоғарылады (3f-сурет, қосымша 5a-сурет).Осы тұжырымға сәйкес, гельдеу жағдайында NT және His-NT2RepCT микроскопиялық зерттеу ThT-позитивті агрегаттардың жергілікті жинақталуынсыз ThT флуоресценциясының біркелкі жоғарылауын анықтады (қосымша 5b,c сурет).ThT-оң фибрилдердің пайда болуы NT және His-NTCT бұлыңғырлығының жоғарылауымен қатар жүрмеді (қосымша 5d сурет), бұл гельдегі фибрилдер желісі гель мөлдірлігін бұзбай түзілуі мүмкін дегенді білдіреді.Алдын ала түзілген фибрилдердің аздаған мөлшерін қосу арқылы себу кейбір амилоидтардың фибрилдерінің түзілуін айтарлықтай жеделдетуі мүмкін42,43,44, бірақ NT гидрокоагулянттарының ерітіндісіне 5%, 10% немесе 20% (салм/сал) НТ қосу.себу әсері (Cурет 3g).Мүмкін, бұл гидрогельдегі фибрилдердің салыстырмалы түрде бекітілген және тұқым ретінде пайдаланылмайтындығына байланысты.
Рекомбинантты спидроин ақуыздарының жоғары температурадағы күтпеген әрекеті гель түзілуіне байланысты конформациялық өзгерістерді анықтау үшін ядролық магниттік-резонанстық (ЯМР) спектроскопиялық зерттеулерді одан әрі жүргізуге түрткі болды.Уақыт өте келе 37°C температурада жазылған His-NT2RepCT ерітінділерінің ЯМР спектрлері CT әлі де ішінара бүктелгенін, ал NT және 2Rep сигналдары жоғалып кеткенін көрсетті (4а-сурет), бұл оның негізінен NT және 2Rep екенін көрсетеді. NT2RepCT гидрогелі.КТ сигналы бастапқы қарқындылығының 20% дейін әлсіреген, бұл КТ негізінен бекітілген және гидрогель құрылымына енгізілген дегенді білдіреді.Алдын ала инкубацияланған үлгідегі сияқты жылжымалы және осылайша ЯМР ерітіндісімен бақыланатын КТ-ның кішірек бөлігі үшін спектрлерде His-NT2Rep бекітілген бөлігінің қиын иммобилизациялануынан болуы мүмкін алғашқы 10 құрылымдық қалдық үшін сигналдар жоқ.Гидрогельдердің -NT2RepCT күйінің ЯМР спектрлері α-спиральдар мен β-қабаттардың басым болуын және аз дәрежеде кездейсоқ катушкалар конформациясын анықтады (4б-сурет).Тек NT-да болатын метионин қалдықтарының химиялық ығысу талдауы бұл доменнің β-парақ құрылымына айналғанын көрсетті.Ерітіндідегі НТ-ның уақытқа тәуелді спектрлері сигнал интенсивтілігінің біркелкі төмендеуін көрсетті (4в-сурет), ал NT гидрогельдерінің қатты күйдегі ЯМР-ы НТ қалдықтарының көпшілігінің β-парақтық құрылымдарға айналғанын көрсетті (4д-сурет).2Rep конформациясын біріктіру үрдісіне байланысты бөлек анықтау мүмкін болмады.Дегенмен, NTCT және His-NT2RepCT гидрогельдерінің қатты күйдегі ЯМР спектрлері өте ұқсас болып көрінді (4б-сурет; Қосымша сурет 6b), бұл 2Rep His-NT2RepCT гидрогелінің құрылымдық бөлігіне аз үлес қосқанын көрсетеді.CT гидрогельдері үшін α-спиральдар, β-парақтар және кездейсоқ спиральды қайталама құрылымдар бар екені анықталды (Қосымша 6d сурет).Бұл КТ-ның кейбір бөліктері α-спираль болып қалады, ал басқалары β-парақтарға айналады деп болжайды.Осылайша, ЯМР спектроскопиясының нәтижелері NT гидрогельді қалыптастыру үшін маңызды екенін және сонымен бірге 2Rep және CT-пен біріктірілген кезде β-парақтық конформацияға айналатынын көрсетеді.Осыған сәйкес, біз жақында амилоидты кеңістіктік сыдырмалардың NT доменінің барлық бес спиральында пайда болуы мүмкін екенін анықтадық және вальс алгоритмі 1 спиральдағы амилоидогенді аймақты болжады (4e-сурет).
15N-HSQC 10 мг/мл His-NT2RepCT ерітіндісінің 2D спектрлері (көк) және инкубациядан кейін 19 сағаттан кейін (қызыл) 37°C.Қызыл спектрдегі жеке крест шыңдар және көк спектрдегі F24, G136, polyA бір әріпті амин қышқылы таңбаларымен және қалдық сандармен белгіленеді.Кірістірілгендер NT, 2Rep және CT домендерінің таңдалған қалдықтары үшін сигнал қарқындылығының уақытқа тәуелділігін көрсетеді.b His-NT2RepCT гидрогельдерінің қатты күйдегі радиожиілік (RFDR) спектрлері.RFDR спектрлерінде байқалған Cα/Cβ қалдықтарының корреляциясы модельдік пептидтердің химиялық ығысуларымен және статистикадан алынған мәндермен салыстыру арқылы анықталды82,83 және олардың қайталама құрылымдары.SSB – айналмалы бүйірлік жолақ.c 37 °C температурада 36 сағат бойы инкубациялау кезінде 15N-HSQC 10 мг/мл NT ерітіндісінің бір өлшемді спектрлері.Кірістіру уақытпен салыстырғанда көлемдік қарқындылықты көрсетеді.d NT гидрогельдерінің қатты күйдегі RFDR спектрлері.RFDR спектрлерінде байқалатын Cα/Cβ қалдықтарының және олардың қайталама құрылымдарының корреляциясы көрсетілген.e Zipper дерекқорындағы NT45.79 фибрилляцияға бейімділік профиліне негізделген (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Гексапептидтің кеңістіктік найзағай ығысу терезесінің Розетта энергиясы ккал/мольмен көрсетілген.Қызыл жолақтар фиброзға бейімділігі жоғары гексапептидтерді білдіреді (Розетта энергиясы -23 ккал/мольден төмен; нүктелі сызықтан төмен).Жасыл жолақтар табалдырықтан жоғары Rosetta энергиясы бар фрагменттерді көрсетеді, сондықтан стерикалық найзағайларды құру ықтималдығы аз.Құрамында пролині бар фрагменттер талдаудан шығарылды (бағандарсыз).Шаршылар Вальс алгоритмі81 (https://waltz.switchlab.org) болжаған амилоидоз аймақтарын көрсетеді.NT аминқышқылдарының қалдықтарының тізбегі жоғарғы жағында, ал β қайталама құрылымында табылған қалдық түрлері (қатты күйдегі ЯМР спектроскопиясы арқылы анықталады) қызыл түспен көрсетілген.Бес NT α-спиральдарының позициялары (H1-H5)28 ретінде белгіленген.
рН <6,5 кезінде HT димерленеді, ол ыстыққа немесе мочевина-индукцияланған денатурацияға төзімді болады18.NT димеризациясы мен тұрақтылығы гельденуге қалай әсер ететінін түсіндіру үшін 100 мг/мл NT бар ерітінділер флаконның инверсия сынағы арқылы рН 8, 7 және 6 деңгейінде бақыланды.рН 8 және 7 инкубацияланған NT үлгілері 37 °C температурада 30 минуттан кейін гельденді, бірақ рН 8 гелі мөлдір болып қалды, ал рН 7 гелі көрінетін тұнбаны көрсетті (5а-сурет).Керісінше, рН 6-да HT бар ерітінді гель түзмеді және 37 ° C температурада 20 минуттан кейін үлкен тұнбаны көруге болады.Бұл димерлердің өздері және/немесе олардың мономерлермен салыстырғанда жоғары тұрақтылығы гельденуді болдырмайтынын көрсетеді.NT үшін рН 7 және 6 тұнбаның түзілуі күтілмеді, өйткені NT 200 мг/мл27 температурада ериді, жылумен денатурациядан кейін оңай қайта оралады, сонымен қатар α-спиральді төмен мәндерде сақтайды. рН 18. Бұл сәйкессіздіктердің ықтимал түсіндірмесі бұрын хабарланған эксперименттер бөлме температурасында немесе одан төмен немесе салыстырмалы түрде төмен ақуыз концентрацияларында жүргізілген16,18,19.
37°C инкубациядан кейін рН 8, 7, 6 және 154 мМ NaCl (рН 8) кезінде NT құтысының инверсия сынағы (100 мг/мл).b тиісінше 154 мМ NaF және 154 мМ NaCl бар және онсыз NT CD спектрлері.222 нм молярлық эллипттілік табиғи қатпарлардың пропорциясына айналады.c NT инверсия талдауы (100 мг/мл) NT* (37 °C және 60 °C), NTA72R (37 °C) және His-NT-L6 (37 °C және 60 °C).d NT*, NTA72R және His-NT-L6 NT мутанттарының CD спектрлері.222 нм молярлық эллипттілік табиғи қатпарлардың пропорциясына айналады.e NTFlSp, NTMiSp және төмендетілген NTMiSp (100 мг/мл) инверсия сынағы.Масштаб жолағы 5 мм.f NT, NTFlSp, NTMiSp және қысқартылған NTMiSp CD спектрлері.222 нм молярлық эллипттілік табиғи қатпарлардың пропорциясына айналады.25 °C және 95 °C температурадағы толық NT спектрлері Қосымша 8-суретте көрсетілген.
Физиологиялық тұз концентрациясы NT суббірліктер арасындағы электростатикалық өзара әрекеттесулерді және NT рН18 төменгі деңгейге ауысуының димеризациясын анықтайды.Біз 154 мМ NaCl және NaF болуы тиісінше гельденуді тежейтінін анықтадық (5a, b-сурет; Қосымша 2б-сурет) және бұл тұздар NT мономерлерінің термиялық тұрақтылығын арттырды (5б-сурет, Қосымша 8-сурет) .Ол сондай-ақ димеризациядан гөрі тұрақтылықты арттыру гельдің пайда болуына жол бермейді деп болжайды.
Протеин димеризациясының және гельденудегі тұрақтылықтың рөлін одан әрі зерттеу үшін біз екі мутант, NT* және NTA72R қолдандық, олар да төмен pH28.30 кезінде мономерлі болып қалады.NT* – қос зарядты қайтаратын мутант, онда мономердің диполярлық зарядының көрінетін таралуы тегістеледі, бұл димерленуді болдырмайды және мономердің тұрақтылығын күрт арттырады.NTA72R - зарядталған диполь, бірақ Arg-алмастырылған Ала димер шекарасында орналасқан, сондықтан мутациялар димерлену үшін қажетті суббірлік өзара әрекеттесулеріне кедергі жасайды.37°C инкубациялау кезінде NT* гидрогель түзген жоқ, ал NTA72R 15 минут бойы мөлдір емес гель түзді (5c-сурет).NT* және NTA72R екеуі де димерлене алмайды, бірақ мономердің тұрақтылығымен ерекшеленеді (5d-сурет), бұл нәтижелер жоғары термодинамикалық тұрақтылық NT-нің гельденуіне жол бермейтінін көрсетеді.Бұл сонымен қатар HT* жоғары температурада тұрақсыз болған кезде гель түзетіндігімен расталады (60°С-та 8 минуттан кейін; 5в-сурет).Бұрын NT құрамындағы метиониннің жоғары мөлшері оның табиғи қатпарлануын сұйылтатыны және алты Met пен Leu алмастырғыштары (мұнда His-NT-L6 деп аталады) NT46 мономерін қатты тұрақтандыратыны бұрын көрсетілген.NT гелін қалыптастыру үшін құрылымдық икемділік қажет деген болжамға сүйене отырып, біз His-NT-L6 тұрақты мутанты 37 °C температурада гельденбегенін анықтадық (5c, d-сурет).Алайда, His-NT-L6 60°С температурада 60 минут инкубациялау кезінде де гель түзді (5c-сурет).
НТ-ның β-парақтық құрылымдарға айналу және гидрогельдерді қалыптастыру қабілеті спидроиннің барлық NT домендерінің кейбіріне емес, кейбіріне қатысты сияқты.Әртүрлі жібек түрлерінен және өрмекші түрлерінен алынған NTs, Trichonephila clavipes (NTFlSp), олардың салыстырмалы түрде төмен мөлшері мен термиялық тұрақтылығына қарамастан гельдер түзді (5e, f-сурет және 2-қосымша кесте).Керісінше, Araneus ventricosus (NTMiSp) шағын ампулярлық ақуыз спидроинінен алынған NT төмен термиялық тұрақтылығы және жоғары метионин мазмұны бар гидрогельдерді түзмеді (Қосымша кесте 2 және 5e, f суреті).Соңғысы молекулаішілік дисульфидті байланыстардың болуымен байланысты болуы мүмкін29,47.Тұрақты түрде NTMiSp дисульфидті байланыстары азайған кезде ол 37°C температурада 10 минут инкубациялаудан кейін гидрогель түзді (5е-сурет).Қорытындылай келе, құрылымдық икемділік НТ-дан гельді қалыптастырудың маңызды, бірақ жалғыз критерийі емес екенін атап өткен жөн.Тиісті болуы мүмкін тағы бір фактор амилоидты фибрилдерді қалыптастыруға бейімділік болып табылады және сыдырма деректер базасы мен вальс алгоритмі арқылы талдау гельдерді қалыптастыру қабілеті мен амилоидогендік аймақтардың болуы, сондай-ақ болжанған аймақтардың ауқымы арасындағы корреляцияны көрсетті. стерикалық найзағайларды қалыптастыру үшін.Корреляция болды (Қосымша 2-кесте және Қосымша 9-сурет).
Қолайлы жағдайларда NT фибрилдер және гельдер түзу қабілеті бізді басқа ақуыз фрагменттерімен NT синтезі әлі де синтез серіктестерінің толық функциясы бар гельдерді құра алады деген гипотеза жасауға әкелді.Мұны тексеру үшін біз NT-тің C-терминусына сәйкесінше жасыл флуоресцентті ақуызды (GFP) және пуриндік нуклеозид-фосфорилазаны (PNP) енгіздік.Алынған синтез белоктары E. coli-де өте жоғары түпкілікті шығымдылықпен экспрессияланды (тиісінше His-NT-GFP және His-NT-PNP үшін 150 мг/л және 256 мг/л шайқау колбалары), көрсетілгенге сәйкес. NT-ге біріктірілген басқа белоктар үшін Анықтама.30. His-NT-GFP (300мг/мл) және His-NT-PNP (100мг/мл) синтез белоктары 37°C температурада 2 сағат және 6,5 сағаттан кейін гельдер түзді және ең бастысы, GFP фракциясы өзгеріссіз қалды.гельденгеннен кейін байқалады, гельденгеннен кейін бастапқы флуоресценция қарқындылығының >70% қалады (6а-сурет).His-NT-PNP ерітінділеріндегі және гельдеріндегі PNP белсенділігін өлшеу үшін бізге синтез ақуызын NT-мен сұйылтуға тура келді, себебі таза препараттың ферментативті белсенділігі гельдеу концентрацияларында талдаудың анықтау диапазонынан тыс болды.Құрамында 0,01 мг/мл His-NT-PNP және 100 мг/мл NT бар қоспамен түзілген гель алдын ала инкубацияланған үлгілердің бастапқы ферментативті белсенділігінің 65%-ын сақтап қалды (6б-сурет).Гель өлшеу кезінде өзгеріссіз қалды (Қосымша 10-сурет).
a His-NT-GFP (300 мг/мл) және құрамында His-NT-GFP гидрогелі (300 мг/мл) бар төңкерілген құты көрінетін және ультракүлгін сәуле астында гельденгенге дейін және одан кейінгі салыстырмалы флуоресценция қарқындылығы.Нүктелер жеке өлшемдерді көрсетеді (n = 3), қате жолақтары стандартты ауытқуды көрсетеді.Орташа мән қате жолақтарының ортасында көрсетіледі.b PNP белсенділігі NT (100 мг/мл) және құрамында 0,01 мг/мл his-NT-PNP және 100 мг/мл Жаңа Тайвань доллары бар қоспадан тұратын ерітінділер мен гельдерді пайдаланып флюорометриялық талдау арқылы алынды.Кірістіруде құрамында His-NT-PNP (5 мм масштабтағы жолақ) бар гидрогель бар төңкерілген құты көрсетілген.
Мұнда біз протеин ерітіндісін 37°C температурада инкубациялау арқылы НТ және басқа рекомбинантты спидроин белоктарынан гидрогельдердің түзілуін хабарлаймыз (1-сурет).Желдену α-спиральдардың β-қабаттарға айналуымен және амилоид тәрізді фибрилдердің түзілуімен байланысты екенін көрсетеміз (3 және 4-суреттер).Бұл нәтиже таң қалдырады, өйткені NT - бірнеше күн бойы 4°C температурада >200 мг/мл концентрацияда өте жоғары ерігіштігімен және жоғары тұрақтылығымен белгілі ширатылған глобулярлы бес спиральді байламдар27.Сонымен қатар, NT-тер μМ-де төмен ақуыз концентрациясында жылу денатурациясынан кейін оңай қайта оралады.Біздің нәтижелеріміз бойынша фибрилді қалыптастыру үшін >10 мг/мл ақуыз концентрациясы мен сәл жоғары температура комбинациясын қажет етеді (Cурет 1).Бұл физиологиялық жағдайларда термиялық ауытқуларға байланысты жартылай ашылмаған күйде болатын глобулярлы бүктелген белоктардан амилоидты фибрилдер түзілуі мүмкін деген идеяға сәйкес келеді 48 .Бұл түрлендіруден өтетін белоктардың мысалдарына инсулин49,50, β2-микроглобулин, транстиретин және лизоцим51,52,53 жатады.NT өзінің табиғи күйінде α-спираль болғанымен, полипептидтік тізбектің шамамен 65% стерикалық найзағай түзілуімен үйлесімді (4е-сурет) 45 .Мономер динамикалық мобильді болғандықтан46, ол бұл әлеуетті амилоидогенді аймақтарды орташа жоғары температурада және жалпы ақуыздың жоғары концентрацияларында амилоидты фибрилдің түзілуі үшін критикалық концентрацияға жетуі мүмкін54.Осы негіздемеге сүйене отырып, біз спидроин концентрациясы мен гельдену уақыты арасындағы теріс корреляцияны таптық (1c-сурет), және егер мономерлі NT конформациясы мутациялар (NT*, His-NT-L6) немесе тұз қосу арқылы тұрақтандырылса, оның алдын алады. түзілу гидрогельдері (5-сурет).
Көп жағдайда амилоидты фибрилдер ерітіндіден тұнба түрінде жоғалады, бірақ белгілі бір жағдайларда олар гидрогельдер түзе алады55,56,57.Гидрогельді құрайтын фибрилдер әдетте жоғары пропорцияға ие және молекулалық түйісу арқылы тұрақты үш өлшемді желілерді құрайды, 55,58 біздің нәтижелерімізге сәйкес келеді.In vitro гидрогельді қалыптастыру үшін ақуыздар көбінесе толық немесе ішінара ашылады, мысалы, органикалық еріткіштердің, жоғары температураның (70–90°C) және/немесе төмен рН (1,5–3,0) 59,60,61,62 әсерінен.Мұнда сипатталған спидроин гидрогельдері қатаң өңдеуді қажет етпейді және гидрогельдерді тұрақтандыру үшін кросс-байланыстырушы агенттерді қажет етпейді.
Жібекті иіру кезінде β-парақ ауыстыруға ұшырайтын сияқты көрінетін спидроиннің қайталануы және QD гидрогельдер түзетіні бұрын хабарланған.Біздің қорытындыларымызбен салыстырғанда инкубация уақыттары және/немесе инкубация температурасы тиісінше айтарлықтай ұзағырақ немесе жоғары болды және алынған гидрогельдер жиі мөлдір емес болды (7-сурет және қосымша 1-кесте) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Жылдам гель уақытына қоса, NT гидрогельдері >300 мг/мл (30%) сипатталған барлық басқа рекомбинантты жібек протеинінің гидрогельдерін, сондай-ақ желатин, альгинат (2%), агар (0,5%) сияқты табиғи гидрогельдерден асып түсті. ) және коллаген.(0,6%) (7-сурет және 1 және 3-қосымша кестелер)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Бұл зерттеудегі гидрогельдердің гель уақыты мен серпімділік модулі спидроин негізіндегі басқа гидрогельдермен және таңдалған табиғи гидрогельдермен салыстырылды.Анықтамалар гельдену жағдайларының сипаттамасымен бірге беріледі.APS Аммоний персульфаты, бөлме температурасы.Деректер 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Өрмекшілер спидроинді сақтау кезінде гельденудің алдын алу жолдарын ойлап тапқан сияқты.Жібек безіндегі ақуыздың жоғары концентрациясына қарамастан, терминалдық доменмен байланысты үлкен қайталау аймағы бездегі NT және CT айқын концентрациясы осы зерттеу шекарасында шамамен 10-20 мг/мл сәйкес келетінін білдіреді.in vitro байқалатын гидрогель түзілуі үшін қажет.Сонымен қатар, тұздардың ұқсас концентрациясы 16 жібек бездеріндегідей НТ тұрақтанды (5б-сурет).NT конформациясы E. coli цитозолында зерттелді және in vitro зерттелгеннен гөрі тығызырақ бүктелгені анықталды, бұл одан әрі тұз немесе басқа факторлар оның in vivo агрегациясына кедергі келтіретінін көрсетеді.Дегенмен, NT-тің β-парақ фибрилдеріне айналу қабілеті жіп түзілуі үшін маңызды болуы мүмкін және болашақ зерттеулерде зерттелуі керек.
Осы зерттеуде байқалған NT-амилоид тәрізді фибрилдің және гидрогель түзілуінің жаңа аспектілеріне қоса, біз бұл құбылыстың биотехнологиялық және биомедициналық қолданбалы болуы мүмкін екенін де көрсетеміз (Cурет 8).Тұжырымдаманың дәлелі ретінде біз NT-ны GFP немесе PNP-мен біріктірдік және 37 ° C инкубациялау кезінде синтездік ақуыздың гидрогельдер түзетінін және GFP және PNP фракциялары гельденгеннен кейін олардың белсенділігін айтарлықтай сақтайтынын көрсеттік (6-сурет).Нуклеозидті фосфорилазалар нуклеозидтік аналогтардың75 синтезінің маңызды катализаторы болып табылады, бұл біздің ашылымымызды биофармацевтикалық өнеркәсіп үшін өзекті етеді.Қолайлы жағдайларда мөлдір гидрогельдерді құрайтын синтездік ақуыздарды экспрессиялау тұжырымдамасы ферменттерді иммобилизациялау, бақыланатын дәрілік босату және тіндік инженерия сияқты кең ауқымды қолдану үшін қолайлы қасиеттері бар функционалды гидрогельдерді жасауға мүмкіндік береді.Сонымен қатар, NT және NT* тиімді экспрессиялық маркерлер30 болып табылады, бұл NT және оның нұсқалары еритін синтез белоктарын жоғары өнімді өндіру және кейіннен 3D гидрогельдерінде иммобилизацияланған мақсатты ақуыздарды жасау үшін пайдаланылуы мүмкін екенін білдіреді.
NT ериді, α-спиральді және төмен концентрацияларда (мкМ) және 37°C тұрақты.Бірдей температурада, бірақ жоғарылаған концентрацияда (>10 мг/мл) НТ амилоид тәрізді фибрилдерден тұратын гельдер түзеді.NT синтезінің ақуыздары сонымен қатар толық функционалды синтез фрагменттері бар фибриллярлық гельдерді құрайды, бұл әртүрлі ақуыздарды NT көмегімен 3D гидрогельдерде иммобилизациялауға мүмкіндік береді.Төменгі жағында: NT (PDB: 4FBS) және талшықты желілер мен байланысты ақуыз құрылымдарының иллюстрациялары (болжамды және масштабталмаған, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4R).
Конструкциялар (толық тізімді қоса алғанда, аминқышқылдарының тізбегі үшін Қосымша 4 кестені қараңыз) pT7 плазмидіне клондалады және E. coli BL21 (DE3) түрлендірілді.Құрамында инженерлік плазмидтер бар E. coli канамицин (70 мг/л) қосылған Luria сорпасына егілді және түнде 30°C және 250 айн/мин жылдамдықта өсірілді.Содан кейін культура құрамында канамицин бар LB ортасына 1/100 егілді және OD600 0,8-ге жеткенше 30°C және 110 айн/мин өсірілді.ЯМР зерттеулері үшін бактериялар изотоптармен ақуызды таңбалау үшін құрамында 2 г D-глюкоза 13C (Oldrich) және 1 г аммоний хлориді 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) бар M9 минималды ортада өсірілді.Температураны 20 градус Цельсийге дейін төмендетіңіз және 0,15 мМ изопропилтиогалактопиранозидпен (соңғы концентрация) ақуыз экспрессиясын индукциялаңыз.Түнгі ақуыз экспрессиясынан кейін жасушалар 7278 × г, 4 ° C температурада 20 минут бойы жиналды.Жасуша түйіршіктері 20 мМ Tris-HCl, рН 8-де қайта суспензияланып, әрі қарай пайдаланылғанға дейін мұздатылған.Ерітілген жасушалар 30 кПа температурада ұяшықты бұзушы (TS сериялы машиналар, Constant Systems Limited, Англия) арқылы лизиске ұшырады.Содан кейін лизаттарды 25 000 г 30 минут бойы 4°C температурада центрифугалады.NTMiSp үшін түйіршік содан кейін 2 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl, рН 8 ішінде қайта суспензияланып, 2 минут бойы ультрадыбыстық әсерге ұшырады (2 с қосу/өшіру, 65%), содан кейін 25 000 xg, 4° C температурада қайтадан центрифугадан өтті. 30 мин.Супернатант Ni-NTA бағанына жүктелді, 20 мМ Tris-HCl, 2 мМ имидазол, рН 8-мен жуылды, соңында ақуыз 20 мМ Tris-HCl, 200 мМ имидазол, рН 8 элюцияланды. NT2Rep құру және жасау үшін NTCT, тромбинді қорыту His және NT арасындағы сайтты (ThrCleav) енгізеді.Тромбиннің бөліну орындары His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep шығарады), His-thoredoxin-ThrCleav-NT (NT шығарады), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT шығарады), His-thioredoxin-ThrCleav-NT-де де болады. .* (NT* шығарады), His-thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R шығарады), His-thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp шығарады) және His-Kükürt-редоксин-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp шығарады).Конструкциялар тромбинмен (1:1000) қорытылды және молекулалық салмақ шегі 6-8 кДа болатын Spectra/Por диализ мембранасының көмегімен 20 мМ Tris-HCl, рН 8, 4°C температурада түнде диализден өтті.Диализден кейін ерітінді Ni-NTA колоннасына жүктеледі және қызықты ақуызы бар ағынды су жиналады.Протеин концентрациясы өндірушінің хаттамасына сәйкес Брэдфорд талдауын пайдаланған NTF1Sp қоспағанда, әрбір ақуыздың жойылу коэффициентін пайдалана отырып, 280 нм УК-сіңіруін өлшеу арқылы анықталды.Тазалық SDS полиакриламидті (4–20%) гель электрофорезі және Coomassie тамаша көк бояу арқылы анықталды.Ақуыздар центрифугалық сүзгілерді (VivaSpin 20, GE Healthcare) пайдаланып, 20 минуттық циклдармен 10 кДа молекулалық салмақты шектеумен 4000 xg мөлшерінде шоғырландырылды.
Протеин ерітіндісін ерітіп, 150 мкл мөлдір 1 мл мөлдір аралық флаконға (8 x 40 мм Thermo Scientific) абайлап тамызыңыз.Түтіктердің қақпағы жабылып, булануды болдырмас үшін парафильммен жабылған.Үлгілер (n = 3) 37°C немесе 60°C температурада инкубацияланды және гельденуді бақылау үшін мезгіл-мезгіл төңкерілді.Гельденбеген үлгілер кем дегенде бір апта бойы инкубацияланды.10 мкМ протеинге 10 мМ DTT арқылы NTMiSp дисульфидті байланыстарын азайтыңыз.Табиғи паук жібек жабындарының гельациясын талдау үшін швед көпір өрмекшісі кесілді, екі негізгі ампуляцияланған бездер 200 мкл 20 мМ Tris-HCl буферінің рН 8 ішіне орналастырылды және жабынның бездерден бөлінуіне мүмкіндік беру үшін кесілді..Бездердің мазмұны буферде ерітіледі, құрғақ салмақты анықтау үшін 50 мкл (ашық құтыларды тұрақты салмаққа 60 ° C температурада инкубациялау арқылы) және 37 ° C-та гельдену үшін 150 мкл.
Өлшеу геометриясы/құралы жоғарғы диаметрі 20 мм және саңылау 0,5 мм болатын параллель пластина арқылы баспайтын болаттан жасалған.Үлгіні 25 °C-тан 45 °C-қа дейін және қайтадан 25 °C-қа дейін минутына 1 °C жылдамдықпен тот баспайтын болаттан жасалған түбі Пельтиер тақтасын пайдаланып қыздырыңыз.Діріл өлшеулері 0,1 Гц жиілікте және материалдың сызықтық тұтқыр серпімді аймағында сәйкесінше 100 мг/мл және 300-500 мг/мл үлгілер үшін 5% және 0,5% штаммда жүргізілді.Булануды болдырмау үшін арнайы ылғалдылық камерасын пайдаланыңыз.Деректер Prism 9 көмегімен талданды.
Бөлме температурасында 800-ден 3900 см–1-ге дейінгі инфрақызыл (ИК) спектрлерді жинауға арналған.ATR құрылғысы, сондай-ақ спектрометр арқылы өтетін жарық жолы эксперимент алдында және оның барысында құрғақ сүзілген ауамен тазартылады.Ерітінділер (спектрлердегі суды сіңіру шыңдарын азайту үшін 500 мг/мл) кристалдарға тамшуырмен құйылды, ал гельдер (500 мг/мл) өлшеу алдында түзіліп, содан кейін кристалдарға (n = 3) ауыстырылды.1000 сканерлеу 2 см-1 рұқсатымен және нөлдік жұмыс циклі 2 жазылды. Екінші туынды тоғыз нүктелік тегістеу диапазоны арқылы OPUS (Bruker) көмегімен есептелді.Спектрлер Ф.Менгестің «Spectragryph – Optical Spectroscopy Software» көмегімен 1720 және 1580 см-1 арасындағы бірдей интеграциялық аймаққа қалыпқа келтірілді.ATR-IR спектроскопиясында инфрақызыл сәуленің үлгіге ену тереңдігі толқын санына тәуелді, бұл жоғары толқын сандарына қарағанда төменгі толқын сандарында күштірек жұтуға әкеледі.Бұл әсерлер суретте көрсетілген спектрлер үшін түзетілмеген.3 себебі олар өте кішкентай (Қосымша 4-сурет).Бұл көрсеткіш үшін түзетілген спектрлер Bruker OPUS бағдарламалық құралы арқылы есептелді.
Негізінде, белок конформациясын жан-жақты сандық анықтау амид I шыңы шегінде компоненттерді сенімді деконволюциялаудан кейін мүмкін болады.Алайда іс жүзінде кейбір кедергілер туындайды.Спектрдегі шу деконволюция кезінде (жалған) шыңдар ретінде көрінуі мүмкін.Сонымен қатар, судың иілуіне байланысты шыңы амид I шыңының позициясымен сәйкес келеді және осы жерде зерттелген сулы гель сияқты судың көп мөлшері бар үлгілер үшін ұқсас шамаға ие болуы мүмкін.Сондықтан біз амид I шыңын толығымен ыдыратуға әрекет жасамадық және біздің бақылауларымыз тек ЯМР спектроскопиясы сияқты басқа әдістерді қолдау ретінде қарастырылуы керек.
50 мг/мл NT және His-NT2RepCT ерітінділері түнде 37°C температурада гельденді.Содан кейін гидрогель 12,5 мг/мл концентрацияға дейін 20 мМ Tris-HCl (рН 8) сұйылтылған, жақсылап шайқалған және гельді бұзу үшін тамшуырмен құйылған.Содан кейін гидрогель 10 рет 20 мМ Tris-HCl (рН 8) сұйылтылған, үлгінің 5 мкл формвармен қапталған мыс торына жағылған және артық үлгі сүрткіш қағазбен жойылған.Үлгілер екі рет 5 мкл MilliQ суымен жуылды және 1% уранил форматымен 5 минут бойы боялды.Артық дақты сіңіргіш қағазбен алып тастаңыз, содан кейін торды ауамен құрғатыңыз.Бейнелеу осы торларда 100 кВ жұмыс істейтін FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN көмегімен орындалды.Суреттер Veleta 2k × 2k CCD камерасы (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Мюнстер, Германия) көмегімен x 26 500 және x 43 000 үлкейтумен жазылды.Әрбір үлгі үшін (n = 1) 10–15 кескін жазылды.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) кескінді талдау және талшық диаметрлерін өлшеу үшін пайдаланылды (n = 100, әртүрлі талшықтар).Призма 9 жұпталмаған t-тесттерді (екі құйрықты) орындау үшін пайдаланылды.Орташа His-NT2RepCT және NT фибрилдері сәйкесінше 11,43 (SD 2,035) және 7,67 (SD 1,389) нм болды.Сенім аралығы (95%) -4,246-дан -3,275-ке дейін.еркіндік дәрежесі = 198, p <0,0001.
Құрамында 10 мкМ тиофлавин T (ThT) бар 80 мкл сұйық үлгілер үш данада (n = 3) Corning 96 шұңқырлы қара түбі мөлдір түбі пластиналарын (Corning Glass 3881, АҚШ) пайдаланып, статикалық жағдайда өлшенді.Флуоресценция айырмашылықтары 440 нм қоздыру сүзгісі және 480 нм эмиссия сүзгісі (BMG Labtech фирмасының FLUOStar Galaxy, Оффенбург, Германия) көмегімен жазылды.ThT сигналы қаныққан да, сөндірілмеген де болды, өйткені ThT әртүрлі концентрациясы бар тәжірибелер сигнал қарқындылығын өзгертпей орындалды.Тұманды өлшеу үшін 360 нм абсорбентті жазыңыз.Тұқым себу тәжірибелері үшін 100 мг/мл гельдер 37°C температурада түзілді, қайта суспензияланды және 5%, 10% және 20% молярлық қатынаста себу үшін пайдаланылды.Деректер Prism 9 көмегімен талданды.
His-NT2RepCT және NT >100 мг/мл қорларын мұзда ерітіңіз және 0,22 мкм сүзгі арқылы сүзіңіз.Концентрациялар Nanodrop көмегімен 280 нм абсорбцияны өлшеу арқылы есептелді.Мөлдір түбі бар 96 шұңқырлы қара байланыспайтын пластинаның (Корнинг) ұңғымаларында үлгілер 20 мг/мл дейін 20 мМ Tris-HCl pH 8 сұйылтылған және 5 мкм ThT (соңғы концентрация), жалпы үлгі концентрациясы араластырылған. 50 мкл көлемі.Үлгілер әр 10 минут сайын 37 °C температурада CellObserver (Zeiss) микроскопында өткізілетін жарық арнасы және ThT кескініне арналған FITC қоздыру және эмиссия сүзгілері жинағымен кескінделді.Суретке түсіру үшін 20x/0,4 объектив пайдаланылады.Кескінді талдау үшін Zen Blue (Zeiss) және ImageJ (https://imagej.nih.gov/) пайдаланылды.Гельдер сонымен қатар құрамында 20 мМ Tris pH 8 және 5 мкМ ThT бар 50 мг/мл концентрацияда NT және His-NT2RepCT ерітінділерінен дайындалды және 37°C температурада 90 минут инкубацияланды.Гель бөліктері 20 мМ Tris, рН 8 және 5 мкМ ThT бар жаңа ұңғымаға қосылмайтын қара 96 ұңғыма мөлдір төменгі пластинаға ауыстырылды.20x/0,4 ұлғайту кезінде жасыл флуоресценция мен жарқын өріс кескіндерін алыңыз.ImageJ кескінді талдау үшін пайдаланылды.
Ерітінді ЯМР спектрлері QCI төрт полюсті резонанстық импульстік градиент өрісі криоподымен (HFCN) жабдықталған 600 МГц Bruker Avance Neo спектрометрінде 310 К-де алынды.20 мМ Tris-HCl (рН 8), 0,02% (салм/көлем) NaN3, 5% DO (көлем/көлем), (n = 1) ерітілген, 13C, 15N таңбаланған 10 мг/мл біртекті ақуызды қамтитын ЯМР үлгілері .NT2RepCT химиялық ығысулары рН 6,7 кезінде 15N-HSQC 2D спектрінде 23 шыңын тағайындау үшін пайдаланылды.
3,2 мм 13C/15N{1H} электронсыз зондпен жабдықталған 800 МГц жиілікте Bruker Avance III HD спектрометрінде 13C, 15N таңбаланған гидрогельдердің сиқырлы бұрышты айналдыратын қатты ЯМР (MAS) спектрлері жазылды.Үлгі температурасы 277 К айнымалы температурадағы газ ағыны арқылы бақыланды. Екі өлшемді дипольдік айналмалы резонанс (DARR)76 және радиожиілікті қайта қосу (RFDR)77 спектрлері сәйкесінше 12,5 кГц және 20 кГц MAS жиіліктерінде алынды.1Н-ден 13С-қа дейінгі айқас поляризация (CP) 1H кезінде 60,0-ден 48,0 кГц-ке дейін, 13C кезінде 61,3/71,6 кГц (12,5/20 кГц MAS) және байланыс уақыты 0,5–1 мс аралығындағы сызықтық рампа арқылы орындалды.Деректерді жинау кезінде 73,5 кГц жиілікте Spinal6478 ажырату қолданылды.Түсіру уақыты 10 миллисекунд, ал циклдің кешігуі 2,5 секунд болды.RFDR спектрлерінде байқалған бір байланысқан Cα/Cβ корреляциялары DARR спектрлеріндегі қалдық түріндегі тән химиялық ығысулар мен көбейтінділік корреляциялар негізінде тағайындалды.
Zipper79 дерекқоры (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp және NTMiSp үшін флютер тенденциялары мен Rosetta энергиясын бағалау үшін пайдаланылды.Zipper дерекқоры ақуыз құрылымын модельдеу және талдау үшін бірнеше бос энергия функцияларын біріктіретін Rosetta Energy80 есептейді.Энергия деңгейі -23 ккал/моль немесе одан төмен фибрилляцияға жоғары бейімділігін көрсетеді.Төменгі энергия найзағай конформациясындағы екі β-жіптің тұрақтылығын білдіреді.Сонымен қатар, вальс алгоритмі NT, NTFlSp және NTMiSp Ref-те амилоидогенді аймақтарды болжау үшін пайдаланылды.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT протеинінің ерітіндісі рН мәнін тиісінше рН 6 және 7-ге дейін төмендету үшін рН 5,5 және 6,0 кезінде 2-(N-морфолино)этансульфон қышқылы (MES) буферімен араластырылды.Ақуыздың соңғы концентрациясы 100 мг/мл болды.
Өлшемдер J-1500 CD спектрометрінде (JASCO, АҚШ) оптикалық жолы 0,1 см болатын 300 мкл кюветаны пайдаланып орындалды.Ақуыздар 20 мМ фосфат буферінде (рН 8) 10 мкм (n = 1) дейін сұйылтылған.Тұздың қатысуымен ақуыз тұрақтылығын талдау үшін ақуыздар сәйкесінше 154 мМ NaF немесе NaCl бар 20 мМ фосфат буферінде (рН 8) бірдей концентрацияда (n = 1) талданды.Температура сканерлері 222 нм-де 25°C-тан 95°C-қа дейін 1°C/мин қыздыру жылдамдығымен жазылды.Табиғи бүктелген белоктардың үлесі (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) формуласы арқылы есептелді.Сонымен қатар, әрбір үлгі үшін 260 нм-ден 190 нм-ге дейін 25 ° C температурада және 95 ° C дейін қыздырғаннан кейін бес спектрлер жазылды.Бес спектр орташаланған, тегістелген және молярлық эллипстікке айналдырылған.Деректер Prism 9 көмегімен талданды.
His-NT-GFP (300 мг/мл, 80 мкЛ) флуоресценция қарқындылығы статикалық жағдайда қара мөлдір түбі бар 96 шұңқырлы Corning пластиналарында (Corning Glass 3881, АҚШ) үш данада (n = 3) өлшенді.Үлгілерді қоздыру толқын ұзындығы 395 нм флуоресценция негізіндегі пластина оқу құралымен өлшеңіз және сәулеленуді гельдену алдында 509 нм және 2 сағаттан кейін 37°C температурада жазыңыз.Деректер Prism 9 көмегімен талданды.
Пуриндік нуклеозид-фосфорилаза белсенділігін талдау жинағы (фторометриялық әдіс, Sigma Aldrich) өндірушінің нұсқауларына сәйкес пайдаланылды.Құрамында His-NT-PNP бар гельдер мен ерітінділердегі белсенділікті өлшеу үшін 10 нг His-NT-PNP мен 100 мг/мл NT жалпы көлемі 2 мкл болатындай араластырыңыз, себебі гель жиынтықты анықтау аралығынан жоғары сигнал берді.His-NT-PNP жоқ гельдер мен ерітінділерді басқару элементтері қамтылған.Өлшемдер екі рет жүргізілді (n = 2).Белсенділік өлшенгеннен кейін реакция қоспасы алынып тасталды және гель өлшеу кезінде бұзылмағанына көз жеткізу үшін фотосуретке түсірілді.Деректер Prism 9 көмегімен талданды.
Зерттеу дизайны туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақалаға сілтеме жасалған Табиғатты зерттеу рефератын қараңыз.
1 және 2-суреттерде бастапқы деректер берілген.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, және 6, Қосымша сур.3, қосымша сур.5a, d, қосымша сурет.6 және қосымша сур.8. Осы зерттеудің деректері Zenodo дерекқорында орналастырылған https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Осы зерттеуде алынған NMR деректері bmrbig36 жазба идентификаторы астында BMRBig репозиторийіне орналастырылды.GFP және PNP құрылымдары PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) ішінен алынды.
Rising, A. және Johansson, J. Spinning жасанды өрмекші жібек.Ұлттық химия.биология.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes геномы өрмекші жібек гендерінің әртүрлілігін және олардың күрделі экспрессиясын көрсетеді.Ұлттық Генетта.49, 895–903 (2017 ж.).