Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Әр слайдта үш мақаланы көрсететін слайдерлер.Слайдтар арқылы жылжу үшін артқа және келесі түймелерді немесе әр слайд бойынша жылжу үшін соңында слайд контроллері түймелерін пайдаланыңыз.
Өнімнің толық сипаттамасы
304 Тот баспайтын болаттан дәнекерленген ширатылған түтік /құбыр
1. Техникалық сипаттамасы: Тот баспайтын болаттан жасалған түтік / түтік
2. Түрі: дәнекерленген немесе жіксіз
3. Стандарт: ASTM A269, ASTM A249
4. Тот баспайтын болаттан жасалған катушка түтігінің OD: 6 мм-ден 25,4 мм-ге дейін
5. Ұзындығы: 600-3500MM немесе тапсырыс берушінің талабы бойынша.
6. Қабырғасының қалыңдығы: 0,2 мм - 2,0 мм.
7. Төзімділік: OD: +/-0,01мм;Қалыңдығы: +/-0,01%.
8. Орамның ішкі тесік өлшемі: 500MM-1500MM (тұтынушының талаптарына сәйкес реттеуге болады)
9. Орам биіктігі: 200MM-400MM (клиент талаптарына сәйкес реттеуге болады)
10. Беті: Ашық немесе күйдірілген
11. Материал: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, қорытпасы 625, 825, 2205, 2507, т.б.
12. Қаптама: ағаш қораптағы тоқылған сөмкелер, ағаш паллет, ағаш білік немесе тапсырыс берушінің талабы бойынша
13. Сынақ: химиялық құрамдас бөлік, аққыштық шегі, созылу күші, қаттылықты өлшеу
14. Кепілдік: Үшінші тараптың (мысалы: SGS TV ) тексеруі және т.б.
15. Қолданылуы: Декорация, жиһаз, мұнай тасымалдау, жылу алмастырғыш, қоршау жасау, қағаз жасау, автомобиль, тамақ өңдеу, медициналық және т.б.
Тот баспайтын болаттың барлық химиялық құрамы мен физикалық қасиеттері төмендегідей:
| Материал | ASTM A269 Химиялық құрамы % Макс | ||||||||||
| C | Mn | P | S | Si | Cr | Ni | Mo | Н.Б | Nb | Ti | |
| TP304 | 0,08 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 18,0-20,0 | 8,0-11,0 | ^ | ^ | ^ . | ^ |
| TP304L | 0,035 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 18,0-20,0 | 8,0-12,0 | ^ | ^ | ^ | ^ |
| TP316 | 0,08 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 16,0-18,0 | 10,0-14,0 | 2.00-3.00 | ^ | ^ | ^ |
| TP316L | 0,035 D | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 16,0-18,0 | 10,0-15,0 | 2.00-3.00 | ^ | ^ | ^ |
| TP321 | 0,08 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 17,0-19,0 | 9,0-12,0 | ^ | ^ | ^ | 5С -0,70 |
| TP347 | 0,08 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 17,0-19,0 | 9,0-12,0 | 10С -1,10 | ^ | ||
| Материал | Термиялық өңдеу | Температура F (C) Мин. | Қаттылық | |
| Бринелл | Роквелл | |||
| TP304 | Шешім | 1900 (1040) | 192HBW/200HV | 90HRB |
| TP304L | Шешім | 1900 (1040) | 192HBW/200HV | 90HRB |
| TP316 | Шешім | 1900(1040) | 192HBW/200HV | 90HRB |
| TP316L | Шешім | 1900(1040) | 192HBW/200HV | 90HRB |
| TP321 | Шешім | 1900(1040) Ф | 192HBW/200HV | 90HRB |
| TP347 | Шешім | 1900(1040) | 192HBW/200HV | 90HRB |
| OD, дюйм | OD төзімділігі дюйм(мм) | WT төзімділігі % | Ұзындығы төзімділік дюйм(мм) | |
| + | - | |||
| ≤ 1/2 | ± 0,005 (0,13) | ± 15 | 1/8 (3,2) | 0 |
| > 1/2 ~1 1/2 | ± 0,005(0,13) | ± 10 | 1/8 (3,2) | 0 |
| > 1 1/2 ~< 3 1/2 | ± 0,010(0,25) | ± 10 | 3 / 16 (4,8) | 0 |
| > 3 1/2 ~< 5 1/2 | ± 0,015(0,38) | ± 10 | 3 / 16 (4,8) | 0 |
| > 5 1/2 ~< 8 | ± 0,030(0,76) | ± 10 | 3 / 16 (4,8) | 0 |
| 8~< 12 | ± 0,040(1,01) | ± 10 | 3 / 16 (4,8) | 0 |
| 12~< 14 | ± 0,050(1,26) | ± 10 | 3 / 16 (4,8) | 0 |
Табиғи микробтық қауымдастық филогенетикалық және метаболикалық жағынан алуан түрлі.Ағзалардың аз зерттелген топтарынан басқа1, бұл әртүрлілік экологиялық және биотехнологиялық маңызды ферменттер мен биохимиялық қосылыстарды2,3 ашу үшін бай әлеуетке ие.Дегенмен, мұндай қосылыстарды синтездейтін және оларды тиісті иелерімен байланыстыратын геномдық жолдарды анықтау үшін осы әртүрлілікті зерттеу қиын болып қала береді.Ашық мұхиттағы микроорганизмдердің биосинтетикалық әлеуеті жаһандық ауқымда геномды ажырату деректерін талдаудағы шектеулерге байланысты негізінен белгісіз болып қалады.Мұнда біз 10 000-нан астам теңіз суының үлгілерінен 25 000-нан астам жаңадан қалпына келтірілген жоба геномдары бар өсірілген жасушалардан және жалғыз жасушалардан алынған 10 000-ға жуық микробтық геномдарды біріктіру арқылы мұхиттағы биосинтетикалық гендік кластерлердің әртүрлілігі мен әртүрлілігін зерттейміз.Бұл әрекеттер 40 000-ға жуық болжамды негізінен жаңа биосинтетикалық гендік кластерлерді анықтады, олардың кейбіреулері бұрын күдікті емес филогенетикалық топтарда табылған.Бұл популяцияларда біз өсірілмеген бактериялар филумына жататын және осы ортадағы биосинтетикалық жағынан ең алуан түрлі микроорганизмдердің кейбірін қамтитын биосинтетикалық гендік кластерлерге («Candidatus Eudormicrobiaceae») байытылған ұрпақты анықтадық.Олардың ішінде біз фосфатаза-пептидтік және питонамидтік жолдарды сипаттадық, сәйкесінше әдеттен тыс биоактивті қосылыс құрылымы мен энзимологиясын анықтадық.Қорытындылай келе, бұл зерттеу микробиомаға негізделген стратегиялар нашар түсінілген микробиота мен қоршаған ортада бұрын сипатталмаған ферменттер мен табиғи тағамдарды зерттеуге қалай мүмкіндік беретінін көрсетеді.
Микробтар ғаламдық биогеохимиялық циклдарды жүргізеді, қоректік торларды сақтайды және өсімдіктер мен жануарлардың денсаулығын сақтайды5.Олардың орасан зор филогенетикалық, метаболикалық және функционалдық әртүрлілігі жаңа таксондарды1, ферменттер мен биохимиялық қосылыстарды, соның ішінде табиғи өнімдерді6 ашудың бай әлеуетін білдіреді.Экологиялық қауымдастықтарда бұл молекулалар микроорганизмдерге қарым-қатынастан бәсекелестікке дейін әртүрлі физиологиялық және экологиялық қызметтерді қамтамасыз етеді 2, 7 .Бастапқы функцияларынан басқа, бұл табиғи өнімдер және олардың генетикалық кодталған өндіріс жолдары биотехнологиялық және терапиялық қолдану үшін мысалдар береді2,3.Бұндай жолдар мен байланыстарды анықтауға өсірілген микробтарды зерттеу үлкен септігін тигізді.Дегенмен, табиғи ортаны таксономиялық зерттеулер микроорганизмдердің басым көпшілігі өсірілмегенін көрсетті8.Бұл мәдени бейімділік көптеген микробтармен кодталған функционалдық әртүрлілікті пайдалану мүмкіндігімізді шектейді4,9.
Осы шектеулерді еңсеру үшін соңғы онжылдықтағы технологиялық жетістіктер зерттеушілерге тікелей (яғни, алдын ала культурасыз) микробтық ДНҚ фрагменттерін тұтас қауымдастықтардан (метогеномика) немесе бір жасушалардан тізбеуге мүмкіндік берді.Бұл фрагменттерді үлкенірек геномдық фрагменттерге жинақтау және бірнеше метагеномикалық құрастырылған геномдарды (MAGs) немесе жалғыз күшейтілген геномдарды (SAGs) қайта құру мүмкіндігі сәйкесінше микробиоманы (яғни, микробтық қауымдастықтар мен микробиоманы) таксоцентрлік зерттеулерге маңызды мүмкіндік ашады.жаңа жолдар ашады.берілген ортадағы меншікті генетикалық материал) 10,11,12.Шынында да, соңғы зерттеулер жер бетіндегі микробтар алуан түрлілігінің филогенетикалық көрінісін айтарлықтай кеңейтті1, 13 және бұрын өсірілген микроорганизмдердің анықтамалық геномдық тізбектерімен (REFs)14 қамтылмаған жеке микробтық қауымдастықтардағы функционалдық әртүрліліктің көп бөлігін ашты.Ие геномының контекстінде ашылмаған функционалдық әртүрлілікті орналастыру мүмкіндігі (яғни, геномның рұқсаты) жаңа табиғи өнімдерді кодтайтын әлі сипатталмаған микробтық сызықтарды болжау үшін15,16 немесе мұндай қосылыстарды бастапқы өндірушіге17 қайтару үшін өте маңызды.Мысалы, біріктірілген метагеномдық және бір жасушалы геномдық талдау тәсілі әртүрлі дәрілік потенциалдардың продуценттері ретінде метаболизмге бай губкамен байланысты бактериялар тобы Candidatus Entotheonella-ны анықтауға әкелді18.Дегенмен, әртүрлі микробтық қауымдастықтарды геномдық зерттеудің соңғы әрекеттеріне қарамастан,16,19 Жердегі экожүйелердің ең үлкен мұхиты16,20 үшін жаһандық метагеномдық деректердің үштен екісінен астамы әлі де жоқ.Осылайша, жалпы алғанда, теңіз микробиомасының биосинтетикалық әлеуеті және оның жаңа ферментативті және табиғи өнімдердің репозиторийі ретіндегі әлеуеті айтарлықтай зерттелмеген.
Теңіз микробиомаларының биосинтетикалық әлеуетін жаһандық ауқымда зерттеу үшін біз алдымен филогенетика мен гендік функцияның кең дерекқорын жасау үшін мәдениетке тәуелді және мәдени емес әдістерді қолдану арқылы алынған теңіз микробының геномдарын біріктірдік.Бұл дерекқорды зерттеу биосинтетикалық гендік кластерлердің (BGCs) алуан түрлілігін анықтады, олардың көпшілігі әлі сипатталмаған гендік кластер (GCF) отбасыларына жатады.Сонымен қатар, біз бүгінгі күнге дейін ашық мұхиттағы ең жоғары белгілі BGC әртүрлілігін көрсететін белгісіз бактериялық отбасын анықтадық.Біз екі рибосомалық синтезді және трансляциядан кейінгі түрлендірілген пептидті (RiPP) қазіргі уақытта белгілі жолдардан генетикалық айырмашылықтары негізінде эксперименттік валидация үшін таңдадық.Бұл жолдардың функционалдық сипаттамасы энзимологияның күтпеген мысалдарын, сондай-ақ протеазаны тежеу белсенділігі бар құрылымдық ерекше қосылыстарды анықтады.
Алдымен біз геномды талдау үшін оның бактериялық және археологиялық компоненттеріне назар аудара отырып, жаһандық деректер ресурсын құруды мақсат еттік.Осы мақсатта біз метагеномикалық деректер мен 1038 теңіз суының сынамаларын жаһандық түрде таралған 215 іріктеу алаңынан (ендік диапазон = 141,6 °) және бірнеше терең қабаттардан (тереңдігі 1-ден 5600 м-ге дейін, пелагикалық, мезопелагиялық және абиссальдық аймақтарды қамтитын) біріктірдік.Фон 21,22,23 (1а-сурет, кеңейтілген деректер, 1а-сурет және қосымша 1-кесте).Кең географиялық қамтуды қамтамасыз етумен қатар, іріктеп сүзілген бұл үлгілер теңіз микробиомасының әртүрлі компоненттерін, соның ішінде вирусқа бай (<0,2 мкм), прокариоттарға бай (0,2–3 мкм), бөлшектерге бай (0,8 мкм) салыстыруға мүмкіндік берді. ).–20 мкм) және вирусы жойылған (>0,2 мкм) колониялар.
a, Дүние жүзінде таралған 215 жерден (62°С-тен 79°С.-ге дейін және 179°Б-тен 179°С-ке дейін) жиналған теңіз микробтық қауымдастықтарының жалпыға қолжетімді 1038 геномы (метогеномикасы).Карта тақтайшалары © Esri.Дереккөздер: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ және Esri.b, бұл метагеномдар деректер жинақтарында (түспен белгіленген) саны мен сапасы (әдістері) бойынша ерекшеленетін MAG (әдістер және қосымша ақпарат) қайта құру үшін пайдаланылды.Қайта жасалған MAG-лар жалпыға қолжетімді (сыртқы) геномдармен толықтырылды, оның ішінде қолдан жасалған MAG26, SAG27 және REF.27 OMD құрастырыңыз.c, тек SAG (GORG)20 немесе MAG (GEM)16 негізіндегі алдыңғы есептермен салыстырғанда, OMD теңіз микробтық қауымдастықтарының геномдық сипаттамасын (метогеномикалық оқу картасының жылдамдығы; әдіс) тереңірек және дәйекті ұсынумен екі-үш есе жақсартады. ендік..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD түрлерін кластер деңгейіне топтастыру (95% орташа нуклеотид сәйкестігі) жалпы санын анықтайды 8300-ге жуық түр, олардың жартысынан көбі бұрын GTDB (89-нұсқа) арқылы таксономиялық аннотацияларға сәйкес сипатталмаған e, геномдық тип бойынша түрлерді жіктеу MAG, SAG және REFs филогенетикалық әртүрлілікті көрсетуде бір-бірін жақсы толықтыратынын көрсетті. теңіз микробиомасы.Атап айтқанда, түрлердің 55%, 26% және 11% сәйкесінше MAG, SAG және REF үшін ерекше болды.BATS, Bermuda Atlantic Time Series;GEM, Жер микробиомасының геномдары;GORG, жаһандық мұхит анықтамалық геномы;HOT, Гавай мұхиты уақыт сериясы.
Осы деректер жинағын пайдалана отырып, біз жалпы 26 293 MAG-ны, негізінен бактериялық және археалды қалпына келтірдік (сурет 1b және кеңейтілген деректер, 1б-сурет).Біз бұл MAG-терді әртүрлі орындардан немесе уақыт нүктелерінен (әдістерден) алынған үлгілер арасындағы табиғи реттілік вариациясының бұзылуын болдырмау үшін біріктірілген метагеномдық үлгілерден емес, бөлек жинақтардан жасадық.Сонымен қатар, біз геномдық фрагменттерді олардың көптеген үлгілер (сауалнамаға байланысты 58-ден 610 үлгіге дейін; әдіс) таралу корреляциясы негізінде топтадық.Біз бұл көп уақытты қажет ететін, бірақ маңызды қадам24 екенін анықтадық, ол бірнеше ауқымды MAG16, 19, 25 қайта құру жұмыстарында өткізіп жіберілді және олардың саны (орта есеппен 2,7 есе) мен сапасын (орта есеппен +20%) айтарлықтай жақсартады. геном.мұнда зерттелген теңіз метагеномынан қалпына келтірілді (кеңейтілген деректер, 2а-сурет және қосымша ақпарат).Тұтастай алғанда, бұл күш-жігер бүгінгі күні қол жетімді ең жан-жақты MAG ресурсымен салыстырғанда 4,5 есе теңіз микробтық MAG (егер тек жоғары сапалы MAG ескерілсе, 6 есе) ұлғаюына әкелді16 (Әдістер).Бұл жаңадан жасалған MAG жинағы қолмен таңдалған 830 MAG26, 5969 SAG27 және 1707 REF-мен біріктірілді.Теңіз бактериялары мен архейлердің жиырма жеті түрі 34 799 геномнан тұратын комбинаторлық топтаманы құрады (1б-сурет).
Содан кейін біз теңіз микробтық қауымдастықтарды көрсету және әртүрлі геном түрлерін біріктірудің әсерін бағалау үшін жаңадан жасалған ресурсты бағаладық.Орташа алғанда, біз оның теңіз метагеномдық деректерінің шамамен 40-60%-ын қамтитынын анықтадық (1c-сурет), тереңдікте де, ендікте де алдыңғы MAG есептерін қамтудан екі-үш есе Қосымша серия 16 немесе SAG20.Сонымен қатар, белгіленген жинақтардағы таксономиялық әртүрлілікті жүйелі түрде өлшеу үшін біз геномдық таксономия деректер базасының (GTDB) құралдар жинағын (әдістерін) пайдалана отырып, барлық геномдарға түсініктеме бердік және геном бойынша орташа 95% нуклеотид сәйкестігін қолдандық.28 8304 түр кластерлерін (түрлерін) анықтау.Осы түрлердің үштен екісі (соның ішінде жаңа топтамалар) бұрын ГТДБ-да пайда болған жоқ, олардың 2790-ы осы зерттеуде қайта құрылған MAG көмегімен ашылды (1d-сурет).Сонымен қатар, біз геномдардың әртүрлі түрлерінің өте комплементарлы екенін анықтадық: түрлердің 55%, 26% және 11% сәйкесінше толығымен MAG, SAG және REF-тен тұрады (1e-сурет).Сонымен қатар, MAG су бағанында табылған барлық 49 түрді қамтыды, ал SAG және REF олардың сәйкесінше 18 және 11 түрін ғана көрсетті.Дегенмен, SAG 1300-ге жуық түрді және MAG тек 390 түрді қамтитын SAG Pelagic Bacteriales (SAR11) сияқты ең көп таралған кластардың әртүрлілігін жақсырақ көрсетеді (кеңейтілген деректер, 3a-сурет).Атап айтқанда, REF түрлер деңгейінде MAG немесе SAG-мен сирек қабаттасады және негізінен оқшауланған теңіз үлгілерінің басқа түрлерімен (мысалы, шөгінділер) өзара әрекеттесуіне байланысты, мұнда зерттелген ашық мұхит метагеномдық жиынтықтарында табылмаған шамамен 1000 геномның >95%-ын құрады. .немесе хост-ассоциациялы).Оны ғылыми қауымдастыққа кеңінен қолжетімді ету үшін жіктелмеген фрагменттерді (мысалы, болжамды фагтардан, геномдық аралдардан және MAG реконструкциясы үшін деректер жеткіліксіз геном фрагменттерінен) қамтитын бұл теңіз геномының ресурсын таксономиялық деректермен салыстыруға болады. .Мұхит микробиологиясы дерекқорындағы (OMD; https://microbiomics.io/ocean/) ген функциясы мен контекстік параметрлермен бірге аннотацияларға қол жеткізіңіз.
Содан кейін біз ашық мұхит микробиомаларындағы биосинтетикалық потенциалдың байлығы мен жаңалығын зерттеуге кірістік.Осы мақсатта біз алдымен жалпы 39 055 BGC болжау үшін 1038 теңіз метагеномында (әдістерінде) табылған барлық MAG, SAG және REF үшін antiSMASH қолдандық.Содан кейін біз оларды 6907 артық емес GCF және 151 гендік кластер популяциясына (GCCs; Қосымша 2 кесте және әдістер) тән артықшылықты (яғни, бірдей BGC бірнеше геномдарда кодтауға болады) және метагеномдық деректерді шоғырландырылған BGC фрагментациясын есепке алу үшін топтадық.Толық емес BGC, егер бар болса (Қосымша ақпарат), 44% және 86% жағдайда кем дегенде бір бұзылмаған BGC мүшесін қамтитын GCF және GCC саны сәйкесінше айтарлықтай өскен жоқ.
GCC деңгейінде біз болжанған RiPPs және басқа да табиғи өнімдердің кең таңдауын таптық (2а-сурет).Олардың ішінде, мысалы, арилполиендер, каротиноидтар, эктоиндер және сидерофорлар кең филогенетикалық таралуы және мұхиттық метагеномдардың көптігі бар GCC-ге жатады, бұл микроорганизмдердің теңіз ортасына кең бейімделуін, соның ішінде реактивті оттегі түрлеріне төзімділігін көрсетуі мүмкін, тотығу және осмостық стресс..немесе темірді сіңіру (қосымша ақпарат).Бұл функционалдық әртүрлілік NCBI RefSeq дерекқорында (BiG-FAM/RefSeq, бұдан әрі RefSeq деп аталады)29 сақталған шамамен 190 000 геномның арасындағы шамамен 1,2 миллион BGC талдауынан айырмашылығы бар, ол рибосомалық емес Синтетаза пептидтерінің (NR поликеттері) және (PKS) BGCs (Қосымша ақпарат).Біз сондай-ақ кез келген RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; 2a-сурет және әдістер) мен 53 (35%) GCC-ге тек қана қашықтан қатысты 44 (29%) GCC-ті тек MAG-да таптық, бұл потенциалды ерекшелейді. OMD-де бұрын сипатталмаған химиялық заттарды анықтау.Осы GCC-тердің әрқайсысы өте әртүрлі биосинтетикалық функцияларды білдіретінін ескере отырып, біз ұқсас табиғи өнімдерді кодтауға болжанған BGC-тердің егжей-тегжейлі тобын қамтамасыз ету мақсатында GCF деңгейінде деректерді әрі қарай талдадық29.Барлығы 3861 (56%) анықталған GCF RefSeq сәйкес келмеді және GCF-тің >97% эксперименталды түрде расталған BGC-тердің ең үлкен дерекқорларының бірі MIBiG-де болмады (2б-сурет).Анықтамалық геноммен жақсы көрсетілмеген параметрлерде көптеген әлеуетті жаңа жолдарды табу таңқаларлық емес, бірақ салыстыру алдында BGC-терді GCF-ге дерепликациялау әдісіміз алдыңғы есептерден ерекшеленеді 16 және жаңалықты объективті бағалауға мүмкіндік береді.Жаңа әртүрліліктің көпшілігі (3012 GCF немесе 78%) болжамды терпендерге, RiPP немесе басқа табиғи өнімдерге сәйкес келеді, ал көпшілігі (1815 GCF немесе 47%) биосинтетикалық потенциалына байланысты белгісіз түрлерде кодталған.PKS және NRPS кластерлерінен айырмашылығы, бұл ықшам BGC метагеномдық құрастыру 31 кезінде фрагменттелу ықтималдығы аз және олардың өнімдерінің көп уақыт пен ресурстарды қажет ететін функционалдық сипаттамасына мүмкіндік береді.
Барлығы 39 055 BGC 6 907 GCF және 151 GCC топтарына топтастырылған.a, деректерді ұсыну (ішкі сыртқы).GCC негізіндегі BGC қашықтықтарының иерархиялық кластерленуі, оның 53-і тек MAG арқылы бекітіледі.GCC құрамында әртүрлі таксондардан (ln-трансформацияланған қақпа жиілігі) және әртүрлі BGC кластарынан (шеңбер өлшемі оның жиілігіне сәйкес келеді) BGC-терді қамтиды.Әрбір GCC үшін сыртқы қабат BGC санын, таралуын (үлгілердің пайызы) және қашықтықты (минималды BGC косинус қашықтығы (min(dMIBiG))) BiG-FAM-дан BGC дейін) көрсетеді.Эксперименталды түрде тексерілген BGC (MIBiG) тығыз байланысты BGC бар GCC көрсеткілермен бөлектелген.b GCF-ті болжамды (BiG-FAM) және эксперименталды түрде расталған (MIBiG) BGC-мен салыстыру 3861 жаңа (d–>0,2) GCF табылды.Осы кодтардың көпшілігі (78%) RiPP, терпендер және басқа табиғи өнімдер үшін код.c, 1038 теңіз метагеномында табылған OMD барлық геномдары OMD филогенетикалық қамтуын көрсету үшін GTDB негізгі ағашына орналастырылды.OMD-де ешқандай геномы жоқ қаптамалар сұр түспен көрсетілген.BGC саны берілген кластағы геномға шаққандағы болжамды BGC санының ең үлкен санына сәйкес келеді.Түсінікті болу үшін түйіндердің соңғы 15% қирады.Көрсеткілер Mycobacterium, Gordonia (Rodococcus-тен кейін екінші) және Crocosphaera (Synechococcus-тен кейін екінші) қоспағанда, BGC (>15 BGC) бай кластарды көрсетеді.d, белгісіз c.Eremiobacterota ең жоғары биосинтетикалық әртүрлілікті көрсетті (табиғи өнім түріне негізделген Шеннон индексі).Әрбір жолақ түрдегі ең көп BGC бар геномды білдіреді.T1PKS, PKS I тип, T2/3PKS, PKS II тип және III тип.
Байлық пен жаңалықтан басқа, біз теңіз микробиомасының биосинтетикалық әлеуетінің биогеографиялық құрылымын зерттейміз.Үлгілерді орташа метагеномдық GCF көшірме санының таралуы бойынша топтастыру (әдістер) төмен ендік, жер үсті, прокариоттарға бай және вирусқа кедей қауымдастықтардың, негізінен жер үсті немесе тереңірек күн сәулесінен түсетін сулардың RiPP және BGC терпендеріне бай екенін көрсетті.Керісінше, полярлық, терең теңіз, вирустар мен бөлшектерге бай қауымдастықтар NRPS және PKS BGC көптігімен байланысты болды (кеңейтілген деректер, 4-сурет және қосымша ақпарат).Соңында, біз жақсы зерттелген тропикалық және пелагикалық қауымдастықтар жаңа терпендердің ең перспективалы көздері болып табылатынын анықтадық (Толықтырылған деректер суреті).PKS, RiPP және басқа табиғи өнімдер үшін ең жоғары әлеует (кеңейтілген деректермен 5а-сурет).
Теңіз микробиомаларының биосинтетикалық әлеуетін зерттеуді толықтыру үшін біз олардың филогенетикалық таралуын картаға түсіріп, жаңа BGC байытылған кладтарды анықтауды мақсат еттік.Осы мақсатта біз теңіз микробтарының геномдарын қалыпқа келтірілген GTDB13 бактериялық және архейлік филогенетикалық ағашқа орналастырдық және олар кодтайтын болжамды биосинтетикалық жолдарды қабаттастырдық (2c-сурет).Біз цианобактериялар (Synechococcus) және Tistrella32,33 сияқты Proteus бактериялары сияқты биосинтетикалық әлеуеті үшін белгілі теңіз суының үлгілерінен (әдістеріне) бірнеше BGC байытылған (15-тен астам BGC арқылы ұсынылған) кладтарды оңай анықтадық немесе жақында олардың назарын аудардық. табиғи өнімдер.мысалы, Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus және Planctomycetota34,35,36.Бір қызығы, біз бұл топтамалардан бұрын зерттелмеген бірнеше тұқымды таптық.Мысалы, Planctomycetota және Myxococcota филлеріндегі биосинтетикалық әлеуеті ең бай түрлер сәйкесінше сипатталмаған кандидаттар отрядтары мен тұқымдастарға тиесілі болды (3-қосымша кесте).Бірге алғанда, бұл OMD бұрын белгісіз филогенетикалық ақпаратқа, соның ішінде ферменттер мен табиғи өнімді ашудың жаңа мақсаттары болуы мүмкін микроорганизмдерге қол жеткізуді қамтамасыз етеді деп болжайды.
Әрі қарай, біз BGC-мен байытылған кладты оның мүшелері кодтаған BGC-тің максималды санын санау арқылы ғана емес, сонымен қатар табиғи үміткер өнімдердің әртүрлі түрлерінің жиілігін түсіндіретін осы BGC-тердің әртүрлілігін бағалау арқылы сипаттадық (2c-сурет және әдістер). )..Біз осы зерттеуде биосинтетикалық жағынан ең алуан түрлер арнайы жасалған бактериялық MAG арқылы ұсынылғанын анықтадық.Бұл бактериялар өсірілмеген Candidatus Eremiobacterota филумына жатады, ол бірнеше геномдық зерттеулерден басқа негізінен зерттелмеген37,38.Айта кетерлігі, «шамамен.Eremiobacterota тек жер үсті ортада ғана талданған39 және BGC байытылған мүшелерді қамтымайтыны белгілі емес.Мұнда біз бір түрдің сегіз MAG қайта құрдық (нуклеотидтердің сәйкестігі > 99%) 23. Сондықтан біз грек мифологиясы мен экспедицияларында әдемі сыйлық болып табылатын нереидтің (теңіз нимфасы) атымен аталған «Candidatus Eudoremicrobium malaspinii» түр атауын ұсынамыз.'Ка.Филогенетикалық аннотация 13 сәйкес, E. malaspinii реттілік деңгейінен төмен бұрын белгілі туыстары жоқ және осылайша біз ұсынатын жаңа бактериялық отбасына жатады «Ca.E. malaspinii» типті түр ретінде және «Ca.Eudormicrobiaceae» ресми атауы (Қосымша ақпарат).'Ca қысқаша метагеномдық реконструкция.E. malaspinii геномының жобасы өте төмен кіріс, ұзақ оқылатын метагеномдық реттілік және 75 кб қайталануы бар жалғыз 9,63 Мб сызықтық хромосома ретінде бір үлгіні (Әдістер) мақсатты құрастыру арқылы расталды.қалған жалғыз түсініксіздік ретінде.
Осы түрдің филогенетикалық контекстін анықтау үшін біз мақсатты геномды реконструкциялау арқылы Тара мұхиты экспедициясынан эукариотпен байытылған метагеномдық үлгілерде 40 жақын түрді іздедік.Қысқаша айтқанда, біз метагеномдық оқуларды «Ca.E. malaspinii» деп болжаған және осы іріктеуде рекрутингтің жоғарылауы басқа туыстарының (әдістерінің) болуын көрсетеді деп болжаған.Нәтижесінде біз жаңадан анықталған отбасы (яғни, «Ca. Eudormicrobiaceae») ішінде үш тектегі бес түрді білдіретін 19 MAG комбинациясы 10 MAG таптық.Қолмен тексеруден және сапаны бақылаудан кейін (кеңейтілген деректер, 6-сурет және қосымша ақпарат) біз «Ca.Eudormicrobiaceae түрлері басқа «Са» мүшелеріне қарағанда үлкен геномдарды (8 Мб) және биосинтетикалық потенциалды (әр түрге 14-тен 22 BGC) көрсетеді.Clade Eremiobacterota (7 BGC дейін) (сурет 3a–c).
a, бес 'Ca филогенетикалық позициялары.Eudormicrobiaceae түрлері осы зерттеуде анықталған теңіз желілеріне тән BGC байлығын көрсетті.Филогенетикалық ағашқа барлық 'Ca кіреді.MAG Eremiobacterota және GTDB (89-нұсқа) берілген басқа фила мүшелері (жақшадағы геном сандары) эволюциялық фон (Әдістер) үшін пайдаланылды.Ең сыртқы қабаттар отбасы деңгейіндегі («Ca. Eudormicrobiaceae» және «Ca. Xenobiaceae») және сынып деңгейіндегі («Ca. Eremiobacteria») жіктеулерді білдіреді.Осы зерттеуде сипатталған бес түр әріптік-сандық кодтармен және ұсынылған биномдық атаулармен ұсынылған (Қосымша ақпарат).б, жарайды.Eudormicrobiaceae түрлерінде жеті ортақ BGC ядролары бар.A2 класында BGC болмауы MAG өкілінің толық болмауына байланысты болды (қосымша 3 кесте).BGCs «Ca.Amphithomicrobium» және «Ca.Amphithomicrobium» (А және В қабаттары) көрсетілмеген.c, Барлық BGC «Ca.Eudoremicrobium taraoceanii Тара мұхиттарынан алынған 623 метатранскриптомда экспрессияланғаны анықталды.Қатты шеңберлер белсенді транскрипцияны көрсетеді.Қызғылт сары шеңберлер үй шаруашылығы генінің экспрессия жылдамдығының (әдістерінің) астындағы және үстіндегі лог2-трансформацияланған қатпарлы өзгерістерді білдіреді.d, салыстырмалы молшылық қисықтары (әдістер) 'Ca.Eudormicrobiaceae түрлері мұхит бассейндерінің көпшілігінде және бүкіл су бағанында (жер бетінен кемінде 4000 м тереңдікке дейін) кең таралған.Осы бағалауларға сүйене отырып, біз 'Ca.E. malaspinii' теңіз түбіндегі пелагикалық дәндермен байланысқан қауымдастықтардағы прокариоттық жасушалардың 6% дейін құрайды.Берілген тереңдік қабатының өлшемінің кез келген бөлігінде табылған түрді біз учаскеде бар деп санадық.IO – Үнді мұхиты, NAO – Солтүстік Атлант, NPO – Солтүстік Тынық мұхиты, RS – Қызыл теңіз, SAO – Оңтүстік Атлант, SO – Оңтүстік мұхит, SPO – Оңтүстік Тынық мұхиты.
Саның көптігі мен таралуын зерттеу.Eudormicrobiaceae, біз тапқандай, мұхит бассейндерінің көпшілігінде, сондай-ақ бүкіл су бағанында басым (3d-сурет).Жергілікті жерде олар теңіз микробтары қауымдастығының 6% құрайды, бұл оларды жаһандық теңіз микробиомасының маңызды бөлігіне айналдырады.Сонымен қатар, біз Ca салыстырмалы мазмұнын таптық.Eudormicrobiaceae түрлері және олардың BGC экспрессия деңгейлері эукариотты байытылған фракцияда ең жоғары болды (3c-сурет және кеңейтілген деректер, сурет. 7), бұл бөлшектермен, соның ішінде планктонмен өзара әрекеттесу мүмкіндігін көрсетеді.Бұл бақылау 'Cа-ға біршама ұқсас.Белгілі жолдар арқылы цитотоксикалық табиғи өнімдерді шығаратын Eudoremicrobium BGCs Myxococcus41 сияқты метаболиттерді арнайы шығаратын басқа жыртқыштарға ұқсас жыртқыш мінез-құлық көрсетуі мүмкін (Қосымша ақпарат және кеңейтілген деректер, 8-сурет).Ca-ның ашылуы.Прокариоттық үлгілерде емес, қол жетімді емес (терең мұхит) немесе эукариоттық үлгілердегі Eudormicrobiaceae бұл бактериялар мен олардың күтпеген BGC әртүрлілігінің табиғи тағамдық зерттеулер контекстінде неге түсініксіз болып қала беретінін түсіндіруі мүмкін.
Сайып келгенде, біз жаңа жолдарды, ферменттерді және табиғи өнімдерді ашудағы микробиомаға негізделген жұмысымыздың уәдесін эксперименталды түрде растауға тырыстық.BGC әртүрлі класстарының арасында RiPP жолы жетілген ферменттер арқылы негізгі пептидтің трансляциядан кейінгі әртүрлі модификацияларына байланысты бай химиялық және функционалды әртүрлілікті кодтайтыны белгілі.Сондықтан біз екі 'Cа таңдадық.Eudoremicrobium' RiPP BGCs (3b және 4a-e суреттері) кез келген белгілі BGC (\(\bar{d}\)MIBiG және \(\bar{d}\)RefSeq 0,2-ден жоғары) негізінде жасалған.
a–c, In vitro гетерологиялық экспрессия және in vitro ферменттік талдаулар жаңа (\(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) терең теңіздегі Ca түрлеріне тән RiPP биосинтезінің кластері.E. malaspinii' дифосфорланған өнімдерді өндіруге әкелді.c, жоғары ажыратымдылықтағы (HR) MS/MS (химиялық құрылымдағы b және y иондарымен көрсетілген фрагментация) және ЯМР (кеңейтілген деректер, 9-сурет) көмегімен анықталған модификациялар.d, бұл фосфорланған пептид сүтқоректілердің нейтрофилді эластазасының төмен микромолярлық тежелуін көрсетеді, ол бақылау пептидінде және сусыздандыратын пептидте (химиялық жоюдан туындаған дегидратация) табылмайды.Ұқсас нәтижелермен эксперимент үш рет қайталанды.Мысалы, ақуыз биосинтезінің екінші романының \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) кластерінің гетерологиялық экспрессиясы 46 аминқышқылының негізгі пептидін өзгертетін төрт жетілген ферменттің қызметін түсіндіреді.Қалдықтар HR-MS/MS, изотопты таңбалау және ЯМР талдауы (қосымша ақпарат) болжаған модификация алаңына сәйкес боялады.Үзіктелген түс өзгерту екі қалдықтың кез келгенінде болатынын көрсетеді.Сурет бір ядродағы барлық жетілген ферменттердің белсенділігін көрсету үшін көптеген гетерологиялық құрылымдардың жиынтығы.h, магистральдық амидті N-метиляцияға арналған ЯМР деректерінің иллюстрациясы.Толық нәтижелер күріште көрсетілген.10 кеңейтілген деректермен.i, MIBiG 2.0 дерекқорында табылған барлық FkbM домендері арасындағы жетілген FkbM ақуыз кластері ферментінің филогенетикалық орны N-метилтрансфераза белсенділігі бар осы отбасының ферментін көрсетеді (Қосымша ақпарат).BGCs (a, e), прекурсорлық пептидтік құрылымдар (b, f) және табиғи өнімдердің болжамды химиялық құрылымдары (c, g) схемалық диаграммалары көрсетілген.
Бірінші RiPP жолы (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) тек терең теңіз түрлерінде табылған «Ca.E. malaspinii» және пептид- прекурсордың кодтары (4а, б-сурет).Бұл жетілген ферментте біз лантипептидтік синтазаның дегидратация аймағына гомологты бір функционалды доменді анықтадық, ол әдетте фосфорлануды және 43-тің кейіннен жойылуын катализдейді (Қосымша ақпарат).Сондықтан прекурсорлық пептидтің модификациясы осындай екі сатылы сусыздандыруды қамтиды деп болжаймыз.Дегенмен, тандемдік масс-спектрометрияны (MS/MS) және ядролық магниттік-резонансты спектроскопияны (ЯМР) пайдалана отырып, біз полифосфорланған сызықтық пептидті анықтадық (4c-сурет).Күтпеген болса да, біз оның соңғы өнім екенін растайтын бірнеше дәлелдер желісін таптық: екі түрлі гетерологиялық хост және in vitro талдауларында дегидратация жоқ, жетілген ферменттің каталитикалық дегидратация аймағында мутацияланған негізгі қалдықтарды анықтау.барлығын «Ca» қалпына келтірді.E. malaspinii геномы (кеңейтілген деректер, 9-сурет және қосымша ақпарат) және, сайып келгенде, фосфорланған өнімнің биологиялық белсенділігі, бірақ химиялық синтезделген сусыздандырылған нысаны (4d-сурет).Шын мәнінде, біз оның нейтрофиль эластазасына қарсы төмен микромолярлы протеаза ингибиторлық белсенділігін көрсететінін анықтадық, бұл экологиялық рөлді анықтау әлі де болса да, концентрация диапазонындағы (IC50 = 14,3 мкм) 44 басқа байланысты табиғи өнімдермен салыстырылады.Осы нәтижелерге сүйене отырып, жолды «фосфептин» деп атауды ұсынамыз.
Екінші жағдай - Ca-ға тән күрделі RiPP жолы.Табиғи ақуыз өнімдерін кодтау үшін Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) болжам жасалды (4e-сурет).Бұл жолдар салыстырмалы түрде қысқа BGCs45 арқылы кодталған ферменттер орнатқан әдеттен тыс химиялық модификациялардың күтілетін тығыздығы мен әртүрлілігіне байланысты ерекше биотехнологиялық қызығушылық тудырады.Бұл протеиннің бұрын сипатталған белоктардан айырмашылығы, онда поликерамидтердің негізгі NX5N мотиві де, ландорнамидтердің лантионин ілмегі де жоқ екенін анықтадық 46 .Жалпы гетерологиялық экспрессия үлгілерінің шектеулерін жеңу үшін біз оларды төрт жетілген жол ферментін (әдістерін) сипаттау үшін арнайы Microvirgula aerodenitrificans жүйесімен бірге қолдандық.MS/MS, изотопты таңбалау және ЯМР комбинациясын пайдалана отырып, біз осы жетілген ферменттерді пептидтің 46-амин қышқылының өзегінде анықтадық (сурет 4f,g, кеңейтілген деректер, 10-12-суреттер және қосымша ақпарат).Жетілген ферменттер арасында біз RiPP жолында FkbM O-метилтрансфераза отбасы мүшесінің 47 бірінші пайда болуын сипаттадық және күтпеген жерден бұл жетілген фермент магистральдық N-метиляцияны енгізетінін анықтадық (сурет 4h, i және қосымша ақпарат).Бұл модификация табиғи NRP48 өнімдерінде белгілі болғанымен, амидтік байланыстың ферментативті N-метилденуі күрделі, бірақ биотехнологиялық тұрғыдан маңызды реакция49 болып табылады, ол осы уақытқа дейін RiPP борозиндер тобын қызықтырды.Ерекшелік 50,51.Бұл белсенділікті басқа ферменттер және RiPP отбасыларында анықтау жаңа қолданбаларды ашуы және белоктардың 52 функционалды әртүрлілігін және олардың химиялық әртүрлілігін кеңейтуі мүмкін.Анықталған модификациялар мен ұсынылатын өнім құрылымының әдеттен тыс ұзындығы негізінде біз «питонамид» жол атауын ұсынамыз.
Функционалды түрде сипатталған ферменттер отбасында күтпеген энзимологияның ашылуы қоршаған орта геномикасының жаңа ашылуларға уәде беретінін көрсетеді, сонымен қатар тек реттілік гомологиясына негізделген функционалдық қорытынды жасаудың шектеулі мүмкіндігін көрсетеді.Осылайша, канондық емес биоактивті полифосфорланған RiPPs есептерімен бірге біздің нәтижелер биохимиялық қосылыстардың функционалдық байлығын, әртүрлілігін және әдеттен тыс құрылымдарын толығымен ашу үшін синтетикалық биология күш-жігерін қажет ететін ресурстарды қажет ететін, бірақ маңызды мәнді көрсетеді.
Мұнда біз микробтармен кодталған биосинтетикалық потенциалдың ауқымын және олардың жаһандық теңіз микробиомындағы геномдық контекстін көрсетеміз, нәтижесінде алынған ресурсты ғылыми қауымдастыққа қолжетімді ету арқылы болашақ зерттеулерді жеңілдетеміз (https://microbiomics.io/ocean/).Біз оның филогенетикалық және функционалдық жаңалығының көп бөлігін тек MAG және SAG реконструкциялау арқылы алуға болатынын анықтадық, әсіресе болашақ биобарлау жұмыстарына бағыт бере алатын жеткіліксіз пайдаланылған микробтық қауымдастықтар.Дегенмен, біз бұл жерде 'Ca.Eudormicrobiaceae тегі ретінде, әсіресе биосинтетикалық тұрғыдан «дарынды», ашылмаған микробиотада болжанған көптеген BGC-тер экологиялық және/немесе биотехнологиялық маңызды әсерлері бар қосылыстар беретін бұрын сипатталмаған энзимологияларды кодтауы мүмкін.
Мұхит бассейндеріндегі, терең қабаттардағы және уақыт өте келе жаһандық теңіз микробтық қауымдастықтарын барынша қамту үшін жеткілікті реттілік тереңдігі бар негізгі океанографиялық және уақыттық қатарларды зерттеулердің метагеномикалық деректер жиыны енгізілген.Бұл деректер жиынына (Қосымша 1-кесте және 1-сурет) Тара мұхиттарында (вирустық байытылған, n=190; прокариоттық байытылған, n=180)12,22 және BioGEOTRACES экспедициясы (n=480) мұхиттарында жиналған үлгілердің метагеномикасы кіреді.Гавай мұхиттық уақыт сериясы (HOT, n = 68), Бермуд-Атлантикалық уақыт сериясы (BATS, n = 62)21 және Маласпина экспедициясы (n = 58)23.Барлық метагеномдық фрагменттерден секвенирлеу оқылымдары оқулардан реттілік адаптерлерін жою, сапаны бақылау ретімен салыстырылған оқуларды жою (PhiX геномдары) арқылы BBMap (v.38.71) көмегімен сапа үшін сүзілді және trimq=14, maq=20 арқылы нашар оқу сапасын жояды, maxns = 0 және minlength = 45. Келесі талдаулар орындалды немесе көрсетілген болса, QC көрсеткіштерімен біріктірілді (bbmerge.sh minoverlap=16).QC көрсеткіштері метаSPAdes (қажет болса v.3.11.1 немесе v.3.12) арқылы құрастыру алдында қалыпқа келтірілді (bbnorm.sh мақсат = 40, ақыл тереңдігі = 0).Алынған тірек контигтері (бұдан әрі - тіректер) ең соңында ұзындығы бойынша (≥1 кб) сүзілді.
1038 метагеномдық үлгі топтарға бөлінді және үлгілердің әрбір тобы үшін барлық үлгілердің метагеномдық сапаны бақылау көрсеткіштері әрбір үлгінің жақшаларына бөлек сәйкестендірілді, нәтижесінде жұптық жақшаға алынған топ көрсеткіштерінің келесі саны алынды: Тара теңіз вирустары – байытылған (190×190 ), байытылған прокариоттар (180×180), BioGEOTRACEES, HOT және BATS (610×610) және Маласпина (58×58).Карталау Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 көмегімен орындалды, ол көрсеткіштерді қосымша тораптарға сәйкестендіруге мүмкіндік береді (-a жалаушасы арқылы).Туралаулар ұзындығы кемінде 45 негіз, ≥97% сәйкестік және ≥80% оқу аралығы болуы үшін сүзілді.Алынған BAM файлдары MetaBAT2 (v.2.12.1)55 үшін jgi_summarize_bam_contig_depths сценарийі арқылы әр топ үшін үлгі ішілік және үлгі аралық қамтуды қамтамасыз ету үшін өңделді.Соңында, MetaBAT2-ді –minContig 2000 және –maxEdges 500 үлгілері бар барлық үлгілерде жеке іске қосу арқылы сезімталдықты арттыру үшін жақшалар топтастырылды. Біз MetaBAT2-ді ансамбль боксшысының орнына қолданамыз, өйткені ол тәуелсіз сынақтарда ең тиімді жалғыз боксшы екендігі көрсетілген.және басқа жиі қолданылатын боксшыларға қарағанда 10-50 есе жылдам57.Көптік корреляцияның әсерін тексеру үшін метагеномиканың кездейсоқ таңдалған ішкі үлгісі (Тара мұхитының екі деректер жиынының әрқайсысы үшін 10, BioGEOTRACES үшін 10, әр уақыт сериясы үшін 5 және Маласпина үшін 5) тек үлгілерді қосымша пайдаланды.Ішкі үлгілер қамту туралы ақпаратты алу үшін топтастырылған.(Қосымша Ақпарат).
Қосымша (сыртқы) геномдар кейінгі талдауға қосылды, атап айтқанда, Tara Oceans26 деректер жиынының ішкі жиынынан қолмен таңдалған 830 MAG, GORG20 деректер жинағынан 5287 SAG және 1707 оқшауланған REF және MAR дерекқорынан (MarDB v. 4) деректер. 682 SAGs) 27. MarDB деректер жинағы үшін үлгі түрі келесі тұрақты өрнекке сәйкес келсе, геномдар қолжетімді метадеректер негізінде таңдалады: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]culture| [I|i] оқшауланған'.
Әрбір метагеномдық контейнердің және сыртқы геномдардың сапасы CheckM (v.1.0.13) және Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59 көмегімен бағаланды.CheckM немесе Anvi'o ≥50% толықтық/толықтық және ≤10% ластану/артықтық туралы есеп берсе, метагеномдық жасушалар мен сыртқы геномдарды кейінірек талдау үшін сақтаңыз.Содан кейін бұл ұпайлар геном сапасын қауымдастық критерийлеріне60 сәйкес келесідей жіктеу үшін орташа толықтыққа (mcpl) және орташа ластануға (mctn) біріктірілді: жоғары сапа: mcpl ≥ 90% және mctn ≤ 5%;жақсы сапа: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, орташа сапа: mcpl ≥ 50% және mctn ≤ 10%, әділ сапа: mcpl ≤ 90% немесе mctn ≥ 10%.Сүзілген геномдар сапа көрсеткіштерімен (Q және Q') келесідей корреляцияланды: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (штаммның өзгергіштігі)/100 + 0,5 x log[N50] .(dRep61-де енгізілген).
Әртүрлі деректер көздері мен геном түрлері (MAG, SAG және REF) арасындағы салыстырмалы талдауға мүмкіндік беру үшін dRep (v.2.5.4) көмегімен геном бойынша орташа нуклеотид сәйкестендіру (ANI) негізінде 34 799 геномға сілтеме алынып тасталды.Қайталанатындар)61 95% ANI шегімен28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0,95 -nc 0,2) және түр деңгейінде геномдық кластерлеуді қамтамасыз ететін SpecI63 қолданатын бір көшірме маркер гендер.Әрбір dRep кластері үшін жоғарыда анықталған ең жоғары сапа баллына (Q') сәйкес репрезентативті геном таңдалды, ол түрдің өкілі болып саналды.
Карталау жылдамдығын бағалау үшін BWA (v.0.7.17-r1188, -a) OMD құрамындағы 34,799 геномы бар метагеномдық көрсеткіштердің барлық 1038 жиынын картаға түсіру үшін пайдаланылды.Сапамен басқарылатын оқулар бір жақты режимде салыстырылды және алынған туралаулар тек ≥45 bp ұзындықтағы туралауларды сақтау үшін сүзілді.және сәйкестік ≥95%.Әрбір үлгі үшін дисплей коэффициенті сүзгіден кейін қалған көрсеткіштердің сапаны бақылау көрсеткіштерінің жалпы санына бөлінген пайызы болып табылады.Сол тәсілді қолдана отырып, 1038 метагеномының әрқайсысы 5 миллион кірістіруге дейін қысқартылды (кеңейтілген деректер, 1c-сурет) және OMD және барлық GEM16-да GORG SAG сәйкестендірілді.GEM16 каталогындағы теңіз суынан алынған MAG мөлшері теңіз суының үлгілерін таңдап (мысалы, теңіз шөгінділерінен айырмашылығы) метагеномдық көздердің кілт сөздерін сұрау арқылы анықталды.Атап айтқанда, біз «суды» «экожүйе_санаты», «теңізді» «экожүйе_типі» ретінде таңдаймыз, ал «тіршілік ету ортасын» «терең мұхит», «теңіз», «теңіздік мұхит», «пелагикалық теңіз», «теңіз суы» ретінде сүземіз, «Мұхит», «Теңіз суы», «Жер үсті теңіз суы», «Теңіз бетіндегі су».Нәтижесінде 1823 OTU-ға таратылған 5903 MAG (734 жоғары сапа) болды (осы жерден қараңыз).
Прокариоттық геномдар GTDB-Tk (v.1.0.2)64 арқылы таксономиялық аннотацияланды, әдепкі параметрлері GTDB r89 13 нұсқасына бағытталған. Anvi'o доменді болжау және қайта шақыру ≥50% және артықшылық ≤ 10% негізінде эукариот геномдарын анықтау үшін пайдаланылды.Түрдің таксономиялық аннотациясы оның репрезентативті геномдарының бірі ретінде анықталады.Эукариоттарды (148 MAG) қоспағанда, әрбір геномға прокка (v.1.14.5)65 арқылы функционалды түрде түсініктеме берілді, толық гендерді атады, қажет болған жағдайда «архей» немесе «бактериялар» параметрлерін анықтады. кодтау гендері.және CRISPR аймақтары, басқа геномдық белгілермен қатар.fetchMG (v.1.2)66 арқылы әмбебап бір көшірме маркер гендерін (uscMG) анықтау арқылы болжамды гендерге аннотация жасаңыз, ортоологиялық топтарды тағайындаңыз және eggNOG (v.5.0)68 негізінде emapper (v.2.0.1)67 арқылы сұрау.KEGG дерекқоры (2020 жылдың 10 ақпанында жарияланды) 69. Соңғы қадам ≥70% сұраныс пен тақырыпты қамтумен DIAMOND (v.0.9.30)70 көмегімен ақуыздарды KEGG дерекқорына сәйкестендіру арқылы орындалды.Нәтижелер максималды күтілетін бит жылдамдығының ≥ 50% бит жылдамдығына негізделген NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71 сәйкес сүзгіден өтті (сілтеменің өзі).Әдепкі параметрлері және әртүрлі кластерлік жарылыстары бар antiSMASH (v.5.1.0)72 көмегімен геномдағы BGC-терді анықтау үшін гендік тізбектер кіріс ретінде де пайдаланылды.Барлық геномдар мен аннотациялар интернетте қолжетімді мәтінмәндік метадеректермен бірге OMD-ге жинақталған (https://microbiomics.io/ocean/).
Бұрын сипатталған әдістерге ұқсас12,22 біз CD-HIT (v.4.8.1) OMD-ден бактериялық және архейлік геномдардан >56,6 миллион ақуызды кодтайтын гендерді 95% сәйкестілікке және қысқа гендерге (90% қамту)73 кластерлеу үшін қолдандық. >17,7 миллион ген кластері.Әрбір ген кластері үшін репрезентативті ген ретінде ең ұзын тізбек таңдалды.Содан кейін 1038 метагеномы >17,7 миллион BWA (-a) кластер мүшелеріне сәйкестендірілді және алынған BAM файлдары тек ≥95% сәйкестік пен ≥45 негізгі теңестірулері бар туралауларды сақтау үшін сүзілді.Ұзындығы бойынша нормаланған геннің көптігі ең жақсы бірегей туралаудағы кірістірулерді бірінші рет санау, содан кейін анық емес карталанған кірістірулер үшін бірегей кірістірулердің санына пропорционал сәйкес мақсатты гендерге бөлшек сандарды қосу арқылы есептелді.
Кеңейтілген OMD геномдары («Ca. Eudormicrobiaceae қосымша MAG-терімен», төменде қараңыз) кеңейтілген mOTU анықтамалық дерекқорын жасау үшін mOTUs74 метагеномикалық талдау құралының дерекқорына (v.2.5.1) қосылды.Он uscMG-дан тек алты бір көшірме геномы (23 528 геном) аман қалды.Дерекқорды кеңейту нәтижесінде түр деңгейінде 4 494 қосымша кластер пайда болды.1038 метагеномдар әдепкі mOTU параметрлері арқылы талданды (v.2).644 mOTU кластерінде (95% REF, 5% SAG және 99,9% MarDB тиесілі) қамтылған жалпы 989 геном mOTU профилімен анықталмады.Бұл MarDB геномдарының теңіз оқшаулауының әртүрлі қосымша көздерін көрсетеді (анықталмаған геномдардың көпшілігі шөгінділерден, теңіз иелерінен және т.б. оқшауланған организмдермен байланысты).Осы зерттеуде ашық мұхит ортасына назар аударуды жалғастыру үшін, егер олар табылмаса немесе осы зерттеуде жасалған MOTU кеңейтілген дерекқорына қосылмаса, біз оларды төменгі ағынды талдаудан шығардық.
OMD ішіндегі MAG, SAG және REF барлық BGC (жоғарыдан қараңыз) барлық метагеномдық тіректерде анықталған (antiSMASH v.5.0, әдепкі параметрлер) және BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM домені)75 арқылы сипатталған BGC-термен біріктірілді.Осы мүмкіндіктерге сүйене отырып, біз BGC арасындағы барлық косинус қашықтықтарын есептедік және сәйкесінше 0,2 және 0,8 қашықтық шегін пайдалана отырып, оларды (орта сілтемелер) GCF және GCC деп топтадық.Бұл шекті мәндер бастапқы BiG-SLICE кластерлеу стратегиясындағы кейбір қателерді жеңілдететін косинус қашықтығымен бірге Евклидтік қашықтық75 арқылы бұрын қолданылған шектердің бейімделуі болып табылады (Қосымша ақпарат).
Содан кейін BGCs сүзгіден өтті, бұл бұрын сипатталғандай фрагментация қаупін азайту және 1038 метагеномда табылмаған (жоғарыдан қараңыз) MarDB REFs және SAGs (жоғарыдан қараңыз).Бұл OMD геномымен кодталған жалпы саны 39 055 BGC-ге әкелді, қосымша 14 106 метагеномдық фрагменттерде анықталған (яғни MAG-ге біріктірілмеген).Бұл «метагеномикалық» BGC деректер базасында түсірілмеген теңіз микробиомасының биосинтез потенциалының үлесін бағалау үшін пайдаланылды (Қосымша ақпарат).Әрбір BGC SMASH-қа қарсы немесе BiG-SCAPE76-да анықталған өрескел өнім санаттарымен анықталған болжамды өнім түрлеріне сәйкес функционалды түрде сипатталды.Мөлшерде іріктеу бұрмалануының алдын алу үшін (GCC/GCF таксономиялық және функционалдық құрамы, GCF және GCC сілтеме дерекқорларына дейінгі қашықтық және GCF метагеномдық көптігі) әрбір түр үшін GCF үшін ең ұзын BGC ғана сақтай отырып, 39 055 BGC одан әрі дедупликацияланды, нәтижесінде барлығы 17 689 BGC болды.
GCC және GCF жаңалығы есептелген деректер базасы (BiG-FAM ішіндегі RefSeq дерекқоры)29 және эксперименталды түрде тексерілген (MIBIG 2.0)30 BGC арасындағы қашықтық негізінде бағаланды.17 689 өкілдік BGC әрқайсысы үшін біз тиісті дерекқорға ең кіші косинус қашықтығын таңдадық.Бұл ең аз қашықтықтар сәйкесінше GCF немесе GCC сәйкес орташа (орташа) алынады.Егер дерекқорға дейінгі қашықтық (орташа) GCF мен сілтеме арасындағы идеалды бөлуге сәйкес келетін 0,2-ден үлкен болса, GCF жаңа болып саналады.GCC үшін сілтемелермен ұзақ мерзімді қарым-қатынасты бекіту үшін 0,4 мәнін таңдаймыз, бұл GCF анықтаған шекті мәннен екі есе.
BGC метагеномдық көптігі гендік деңгейдегі профильдерден қолжетімді оның биосинтетикалық гендерінің (анти-SMASH арқылы анықталған) орташа көптігі ретінде бағаланды.Әр GCF немесе GCC метагеномдық көптігі өкілдік BGC қосындысы ретінде есептелді (17 689-дан).Бұл молшылық карталары кейіннен бір үлгідегі mOTU санауын пайдалана отырып, ұялы құрам үшін қалыпқа келтірілді, ол сонымен қатар реттілік әрекеттерін есепке алды (кеңейтілген деректер, 1d-сурет).GCF немесе GCC таралу мөлшері > 0 болатын үлгілердің пайызы ретінде есептелді.
Үлгілер арасындағы евклидтік қашықтық нормаланған GCF профилінен есептелді.Бұл қашықтықтардың өлшемі UMAP77 көмегімен кішірейтілді және алынған кірістірулер HDBSCAN78 көмегімен бақыланбайтын тығыздыққа негізделген кластерлеу үшін пайдаланылды.HDBSCAN пайдаланатын кластер үшін ұпайлардың оңтайлы ең аз саны (демек, кластерлердің саны) кластер мүшелігінің жиынтық ықтималдығын барынша арттыру арқылы анықталады.Анықталған кластерлер (және осы кластерлердің кездейсоқ теңдестірілген ішкі үлгісі дисперсияның пермутационды көп айнымалы талдауында (PERMANOVA) ауытқуды есепке алу үшін) PERMANOVA көмегімен азайтылмаған евклидтік қашықтыққа қарсы маңыздылыққа сыналған.Үлгілердің орташа геномдық өлшемі mOTU салыстырмалы көптігі мен геном мүшелерінің болжамды геном өлшемі негізінде есептелді.Атап айтқанда, әрбір mOTU геномының орташа мөлшері оның мүшелерінің толықтығы үшін түзетілген геном өлшемдерінің орташа мәні ретінде бағаланды (сүзгілеуден кейін) (мысалы, ұзындығы 3 Мб болатын 75% толық геномның түзетілген өлшемі 4 болады). Мб).тұтастығы ≥70% орташа геномдар үшін.Әр үлгі үшін орташа геном мөлшері салыстырмалы молшылықпен өлшенген mOTU геном өлшемдерінің қосындысы ретінде есептелді.
OMD-де геномдық кодталған BGC-тердің сүзілген жинағы бактериалды және архейлік GTDB ағаштарында (≥5 кб шеңберлерде, 1038 метагеномдарда табылмаған REF және SAG MarDB-ны қоспағанда, жоғарыдан қараңыз) және олардың филогенетикалық негізіндегі болжамды өнім санаттарында көрсетілген. геномның орналасуы (жоғарыдан қараңыз).Біз алдымен осы түрдегі ең көп BGC бар геномды өкіл ретінде пайдаланып, түрлер бойынша деректерді азайттық.Визуализация үшін өкілдер одан әрі ағаш топтарына бөлінді және тағы да әрбір жасушалық топ үшін өкіл ретінде ең көп BGC бар геном таңдалды.BGC-мен байытылған түрлер (кемінде >15 BGC бар бір геном) сол BGC-де кодталған өнім түрлері үшін Шеннон әртүрлілік индексін есептеу арқылы әрі қарай талданды.Барлық болжамды өнім түрлері бірдей болса, химиялық гибридтер және басқа да күрделі БГК (анти-SMAH болжамы бойынша) кластердегі ретіне қарамастан (мысалы, ақуыз-бактериоцин және бактериоцин-протеопротеин синтезі) бірдей өнім түріне жатады. денесі).гибридті).
SAMN05421555 биологиялық үлгісіне сәйкес және қысқа оқуға арналған Illumina SRR3962772 метагеномдық оқу жинағына сәйкес келетін, PacBio секвенирлеу протоколына сәйкес өңделген, PacBio секвенирлеу протоколына сәйкес PacBio ambellio үлгісін пайдалану үшін ультра төмен кіріспен өңделген, SAMN05421555 биологиялық үлгісіне сәйкес келетін MP1648 Malaspina үлгісінен қалған ДНҚ (6 нг деп есептеледі). жинақ (100-980-000) және SMRTbell Express 2.0 үлгісін дайындау жинағы (100-938-900).Қысқаша айтқанда, қалған ДНҚ Covaris (g-TUBE, 52104) көмегімен кесілген, жөнделген және тазартылған (ProNex моншақтары).Содан кейін тазартылған ДНҚ кітапхананы дайындауға, күшейтуге, тазартуға (ProNex моншақтары) және өлшемді таңдауға (>6 кб, Blue Pippin) соңғы тазарту қадамына (ProNex моншақтары) және Sequel II платформасында секвенирлеуге ұшырайды.
Алғашқы екі қайта құру шамамен.MAG Eremiobacterota үшін біз алты қосымша ANI >99% анықтадық (олар 3-суретте қамтылған), олар бастапқыда ластану ұпайлары негізінде сүзілген (кейінірек гендердің қайталануы ретінде анықталған, төменде қараңыз).Біз сондай-ақ «Ca» деп белгіленген науаны таптық.Eremiobacterota» әртүрлі зерттеулерден23 және оларды біздің зерттеудегі сегіз MAG-мен бірге төменде келтірілген үлгілер үшін BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, – жалаушаны пайдаланатын 633 эукариоттық байытылған (>0,8 мкм) үлгілердің метагеномдық көрсеткіштеріне сілтеме ретінде пайдаланды. картаға түсіру (5 миллион оқылым).Байытуға арналған арнайы карталар негізінде (95% теңестіру сәйкестігімен және 80% оқу қамтуымен сүзілген) құрастыру үшін 10 метагеном (күтілетін қамту ≥5×) және мазмұн корреляциясы үшін қосымша 49 метагеном (күтілетін қамту ≥1×) таңдалды.Жоғарыдағыдай бірдей параметрлерді пайдалана отырып, бұл үлгілер біріктіріліп, 10 қосымша 'Ca қосылды.MAG Eremiobacterota қалпына келтірілді.Бұл 16 MAG (деректер базасындағы екеуін есептемегенде) кеңейтілген OMD геномдарының жалпы санын 34 815-ке жеткізеді.MAG-ге олардың геномдық ұқсастығы мен GTDB-дегі позициясы негізінде таксономиялық дәрежелер тағайындалады.18 MAG dRep көмегімен бір отбасының ішінде 5 түрге (түрішілік ANI >99%) және 3 ұрпаққа (интрагендік ANI 85% - 94%) бөлінді79.Түр өкілдері тұтастық, ластану және N50 негізінде қолмен таңдалды.Ұсынылатын номенклатура Қосымша ақпаратта берілген.
'Ca тұтастығын және ластануын бағалаңыз.MAG Eremiobacterota, біз uscMG болуын, сондай-ақ CheckM және Anvi'o пайдаланатын тектік және доменге тән бір көшірме маркерлік гендік жиынтықтарды бағаладық.40 uscMGs ішінен 2 телнұсқаның идентификациясы кез келген ықтимал ластануды жоққа шығару үшін филогенетикалық реконструкциямен расталды (төменде қараңыз) (бұл осы 40 маркер геніне негізделген 5% сәйкес келеді).Бес өкілдік MAG 'Ca қосымша зерттеу.Осы реконструкцияланған геномдардағы ластаушы заттардың төмен деңгейі молшылық пен дәйектілік құрамының корреляциясына негізделген интерактивті Anvi'o интерфейсін қолдану арқылы Eremiobacterota түрлері үшін расталды (Қосымша ақпарат)59.
Филогеномикалық талдау үшін біз бес өкілдік MAG «Ca» таңдадық.Eudormicrobiaceae», барлық түрлері «Ca.Eremiobacterota және басқа фила мүшелерінің (соның ішінде UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria және Planctomycetota) геномы GTDB (r89)13.Бұл геномдардың барлығына бір көшірме маркерлік генді экстракциялау және BGC аннотациясы үшін бұрын сипатталғандай аннотацияланған.GTDB геномдары жоғарыда аталған тұтастық пен ластану критерийлеріне сәйкес сақталды.Филогенетикалық талдау Anvi'o Phylogenetics59 жұмыс процесі арқылы орындалды.Ағаш IQTREE (v.2.0.3) (әдепкі опциялар және -bb 1000)80 көмегімен Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81 анықтаған 39 тандемдік рибосомалық белоктардың туралануында құрастырылды.Оның лауазымдары қысқартылды.кем дегенде 50% геномды қамту үшін82 және Planctomycecota GTDB ағаш топологиясына негізделген сыртқы топ ретінде пайдаланылды.40 uscMGs бір ағаш бірдей құралдар мен параметрлерді пайдалана отырып салынды.
Біз жалпы микробтық белгілерді болжау үшін әдепкі параметрлері (фенотип, нуклеотидтерден)83 Traitar (v.1.1.2) қолдандық.Біз геномдағы ақуызды кодтайтын геннің мазмұнына байланысты бұрын жасалған жыртқыштық индекс84 негізінде ықтимал жыртқыш өмір салтын зерттедік.Атап айтқанда, біз DIAMOND көмегімен геномдағы белоктарды OrthoMCL дерекқорымен (v.4)85 – неғұрлым сезімтал – идентификатор 25 – сұрау-мұқаба 70 – тақырып-мұқаба 70 – жоғарғы 20 және сәйкес гендерді санау арқылы салыстыру үшін пайдаланамыз. жыртқыштар мен жыртқыш еместерге арналған маркер гендер.Индекс жыртқыш және жыртқыш емес белгілердің саны арасындағы айырмашылық болып табылады.Қосымша бақылау ретінде біз «Са» геномын да талдадық.Entotheonella TSY118 факторы оның Ca-мен байланысына негізделген.Eudoremicrobium (үлкен геном мөлшері және биосинтетикалық потенциал).Содан кейін біз жыртқыш және жыртқыш емес маркер гендер арасындағы потенциалды байланыстарды және Ca биосинтетикалық потенциалын сынадық.Eudormicrobiaceae» және бір геннен артық емес (маркер генінің кез келген түрінен, яғни жыртқыш/жыртқыш емес ген) BGC-мен қабаттаспайтынын анықтады, бұл BGC жыртқыштық сигналдарын шатастырмайтынын көрсетеді.Шифрленген репликондардың қосымша геномдық аннотациясы секреция жүйесін, пили мен жгутикті86 арнайы тексеру үшін TXSSCAN (v.1.0.2) көмегімен орындалды.
Тара мұхиттарының прокариоттық және эукариоттық байыту фракцияларының22,40,87 (BWA, v.0.7.17-r1188, -a жалаушасы арқылы) 623 метатранскриптомын картаға түсіру арқылы бес өкілді 'Ca картасы жасалды.Eudormicrobiaceae геномы.BAM файлдары 80% оқуды қамту және 95% сәйкестендіруді сүзуден кейін FeatureCounts (v.2.0.1)88 көмегімен өңделді (параметрлерімен featureCounts – негізгі -O – фракция -t CDS, tRNA -F GTF -g ID -p ) Санады бір гендегі кірістіру саны.Жасалған карталар ген ұзындығы мен маркер генінің молдығы mOTU (енгізу саны >0 гендер үшін ұзындық бойынша нормаланған орташа кірістіру саны) үшін қалыпқа келтірілді және әрбір ген деңгейінің жасушасына қатысты салыстырмалы экспрессияны алу үшін лог-22,74-ке түрлендірілді, бұл сонымен қатар реттілік кезінде үлгіден үлгіге дейінгі өзгергіштік.Мұндай арақатынастар салыстырмалы көптік деректерін пайдалану кезінде композиция мәселелерін жеңілдетіп, салыстырмалы талдауға мүмкіндік береді.Геномның жеткілікті үлкен бөлігін анықтауға мүмкіндік беру үшін әрі қарай талдау үшін 10 mOTU маркер гендерінің >5-і бар үлгілер ғана қарастырылды.
'Ca нормаланған транскриптомдық профилі.E. taraoceanii UMAP көмегімен өлшемді азайтуға ұшырады және алынған көрініс өрнек күйін анықтау үшін HDBSCAN (жоғарыдан қараңыз) арқылы бақыланбайтын кластерлеу үшін пайдаланылды.PERMANOVA бастапқы (қысқартылмаған) қашықтық кеңістігінде анықталған кластерлер арасындағы айырмашылықтардың маңыздылығын тексереді.Осы жағдайлар арасындағы дифференциалды экспрессия геном бойынша сыналған (жоғарыдан қараңыз) және 201 KEGG жолы 6 функционалды топта анықталды, атап айтқанда: BGC, TXSSCAN секреция жүйесі және флагеллярлық гендер, деградация ферменттері (протеаза және пептидазалар), жыртқыш және жыртқыш емес. жыртқыш гендер.жыртқыштық көрсеткіш маркерлері.Әрбір үлгі үшін біз әрбір сынып үшін орташа нормаланған өрнекті есептедік (BGC өрнегінің өзі сол BGC үшін биосинтетикалық гендердің медианалық экспрессиясы ретінде есептелетінін ескеріңіз) және мемлекеттер бойынша маңыздылығы тексерілді (FDR үшін түзетілген Крускал-Уоллис сынағы).
Синтетикалық гендер GenScript-тен, ал ПТР праймерлері Microsynth-тен сатып алынды.ДНҚ күшейту үшін Thermo Fisher Scientific фирмасының фузион полимеразасы қолданылды.ДНҚ тазарту үшін NucleoSpin плазмидалары, NucleoSpin гелі және Macherey-Nagel фирмасының ПТР тазарту жинағы пайдаланылды.Рестрикциялық ферменттер мен Т4 ДНҚ лигазасы New England Biolabs компаниясынан сатып алынды.Изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидтен (IPTG) (Биосинт) және 1,4-дитиотреитолдан (DTT, AppliChem) басқа химиялық заттар Sigma-Oldrich компаниясынан сатып алынды және одан әрі тазартусыз пайдаланылды.Антибиотиктер хлорамфеникол (Cm), спектиномицин дигидрохлориді (Sm), ампициллин (Amp), гентамицин (Gt) және карбенициллин (Cbn) AppliChem компаниясынан сатып алынды.Bacto Tryptone және Bacto Yeast Extract медиа құрамдастары BD Biosciences компаниясынан сатып алынған.Секвенирлеуге арналған трипсин Promega-дан сатып алынды.
Ген тізбегі анти-SMASH болжанған BGC 75.1-ден алынған.E. malaspinii (Қосымша ақпарат).
embA (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) және embAM (соның ішінде генаралық аймақтар) синтетикалық және бірізділікпен оңтайландырылған pUCR5 гендер E-дегі өрнек үшін d қашан.embA гені BamHI және HindIII бөліну учаскелерімен pACYCDuet-1(CmR) және pCDFDuet-1(SmR) бірінші көп клондау алаңына (MCS1) қосалқы клондалған.embM және embMopt гендері (кодонмен оңтайландырылған) MCS1 pCDFDuet-1(SmR) ішіне BamHI және HindIII арқылы қосалқы клондалған және pCDFDuet-1(SmR) және pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) екінші көп клондау сайтына орналастырылған. NdeI/ChoI.embAM кассетасы BamHI және HindIII бөліну орындарымен pCDFDuet1(SmR) ішіне қосалқы клондалған.orf3/embI гені (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) EmbI_OE_F_NdeI және EmbI_OE_R_XhoI праймерлерін пайдаланып, қабаттасу кеңейтімі ПТР арқылы құрастырылды, NdeI/XhoMCC және бірдей pDF1SMC арқылы қорытылады, шектеу ферменттері (қосымша кесте).6).Рестрикциялық ферментті қорыту және байлау өндірушінің хаттамасына (New England Biolabs) сәйкес орындалды.
Хабарлама уақыты: 14 наурыз 2023 ж